Le rôle de CD81 et de ses protéines associées dans le mécanisme d'entrée du virus de l'hépat ite C

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A Gabriel , Sem você , nada disso teria sido possível . Sans toi , rien de tout cela n' aurait été possible . Há homens que lutam um dia , e são bons ; Enfin , mon merci le plus spécial , je l' adresse à mes parents , surtout à mon père , pour leur support inconditionnel pendant toutes ces années , pour les bonnes discussions ( au téléphone ) pendant les moments difficiles ... Dans un premier temps , nous avons donc montré qu' EWI- 2 wint , un nouveau partenaire de CD81 , est exprimé dans différentes lignées cellulaires mais pas dans les hépatocytes . L' anticorps MT 81w , qui reconnaît uniquement CD81 associée aux TEM , n' inhibait pas l' infection et la déplétion des cellules en cholestérol , qui inhibe l' infection , n' affectait pas les niveaux de CD81 associée aux TEM . In our study , we analysed the role of CD81 and its associated proteins in HCV entry mechanism . Interestingly , ectopic expression of mouse CD81 ( mCD 81 ) in Huh- 7 w 7 cells was also able to restore HCV permissivity , indicating that mCD 81 in the context of human hepatocytes mimicks hCD 81 in HCV entry and likely in interactions with cellular factors . ADNc & 226;& 128;& 147; ADN complémentaire Des êtres qui luttent pendant longtemps , et c' est très bien ; Puis , il y a ceux qui luttent toute une vie Ce sont eux , les indispensables Berthold Brecht REMERCIEMENTS Tout d' abord je voudrais remercier Laurence pour ces quatre années passées au laboratoire , pour son orientation et support . Elle a été extrêmement importante pour ma formation dans la recherche et pour le développement de mon raisonnement scientifique . Encore une fois merci . Merci aux membres de mon jury de thèse : Claude Boucheix , François Loïc Cosset , Didier Hober , Annie Cahour et Jamal Khalife , pour l' intérêt qu' ils ont porté à mes travaux . Merci à Jean de m' avoir acceptée dans son laboratoire ainsi que d' être un chef accessible . Son aide était importante , surtout pour la fusion des hybridomes ! Merci à mon ancien demi-chef , Czeslaw , pour les discussions / monologues sur les projets , sur les résultats et sur la vie en général . Les repas et les pauses cafés étaient toujours à la fois drôles et constructifs . Merci à Sophana pour son amitié , pour les conseils informatiques et électroniques , pour les figures et surtout pour les blagues ! Merci au groupe des mange-tard , qui s' est développé au fil des années ... Laurence , Czes , Sophana , André , David , Pierre-Yves et Khaled . Un merci spécial à David pour le travail qu' on a fait ensemble et pour sa camaraderie , et un autre à André , le pape de la culture cell , des IF et des bateaux ! Merci au groupe wint , groupe des filles : Claire , Alicia , Yohanna , Birke et ... bienvenue Julie . Merci à Muriel pour le travail et l' amitié pendant toutes ces années , et à Pauline pour le support technique , essentiel pendant la production d' anticorps . A quatre mains c' est beaucoup plus facile ... Merci à Lucie pour tous les moments d' amusement et pour toutes les vannes , et à Yves pour les questions et remarques toujours pertinentes et , bien sûr , pour les mauvaises blagues . Merci à toute l' équipe HCV , passée et présente : Merci à Julie Bertout pour l' utilisation du cytomètre à flux , à Hervé Drobecq pour la spectrométrie de masse , à Marco , Thierry et Christophe pour les aides respectives pendant la conception du protocole de production d' anticorps monoclonaux , pour la réalisation des immunisations et pour les discussions sur les résultats obtenus . Merci à Eric Rubinstein et François Le Naour pour les discussion sur wint . Je remercie également mes amis brésiliens , qui de loin m' ont également supportée , par e-mail , par téléphone et parfois en venant nous rendre visite . Les vrais amis le sont jusqu'à aujourd'hui . Há outros que lutam um ano , e são melhores ; pour tout . Obrigada por serem como são . RESUME Le virus de l' hépatite C ( VHC ) touche 2 à 3 % de la population mondiale et la plupart des individus infectés développent une hépatite chronique qui est fortement associée au développement d' un cancer du foie . Bien que les mécanismes de régulation de l' entrée du VHC dans ses cellules cibles , les hépatocytes , soient encore très mal connus , plusieurs protéines de surface cellulaire ont été identifiées comme des facteurs nécessaires à l' entrée virale . Parmi ces protéines , la tétraspanine CD81 est essentielle à l' entrée du VHC . Les membres de la famille des tétraspanines ont la particularité de s' associer entre eux et avec d' autres protéines , appelées partenaires , pour former des complexes multimoléculaires dans des microdomaines appelés microdomaines enrichis en tétraspanines ( TEM ) . Dans notre étude , nous avons analysé le rôle de CD81 et de ses protéines associées dans le mécanisme d' entrée du VHC . En effet , nous avons identifié un nouveau partenaire de CD81 , EWI- 2 wint , qui inhibe l' infection par le VHC , et nous avons analysé le rôle de la fraction de CD81 associée aux TEM dans l' infection par le VHC . Há aqueles que lutam muitos anos , e são muito bons ; L' expression ectopique d' EWI- 2 wint dans des Huh- 7 , une lignée de cellules hépatiques susceptibles à l' infection par le VHC , bloque l' entrée virale . Nous avons pu montrer que ce blocage se fait par une inhibition de l' interaction entre CD81 et les glycoprotéines d' enveloppe présentes à la surface des particules virales . Notre travail suggère ainsi que l' hépatotropisme du VHC ne serait pas lié uniquement à la présence de facteurs d' entrée spécifiques , mais également à l' absence du facteur inhibiteur EWI- 2 wint . Ce type de mécanisme de contrôle de l' entrée virale par un inhibiteur cellulaire n' avait jamais été décrit auparavant . En parallèle , en utilisant des particules du VHC hautement infectieuses produites en culture cellulaire , nous avons isolé des clones cellulaires indépendants présentant des niveaux d' infection variables . Parmi ces clones , un clone résistant à l' infection avait perdu l' expression de CD81 ( cellules Huh- 7 w 7 ) . L' expression ectopique de la CD81 humaine ( hCD 81 ) dans ce clone a permis de restaurer la permissivité en Huh- 7 . De manière intéressante , l' expression ectopique de la CD81 d' origine murine ( mCD 81 ) dans les cellules Huh- 7 w 7 a également permis de restaurer la permissivité au virus , suggérant que la mCD 81 dans un contexte cellulaire humain est capable de mimer la hCD 81 dans le mécanisme d' entrée du VHC et probablement dans les interactions avec les facteurs cellulaires . Nous avons donc utilisé ces cellules exprimant la mCD 81 et des anticorps monoclonaux décrits précédemment , MT 81 / MT 81w , pour analyser le rôle de CD81 associée aux TEM dans l' infection par le VHC . Porém há os que lutam toda a vida De manière similaire , le traitement des cellules avec de la sphingomyélinase , qui réduit l' infection , augmentait les niveaux de CD81 associée aux TEM . En résumé , nous avons montré que l' entrée du VHC dans ses cellules cibles est directement liée au niveau d' expression de CD81 et la sous-population de CD81 associée aux TEM ne semble pas participer aux étapes initiales du cycle viral du VHC . Mots clés : VHC , mécanisme d' entrée , tétraspanine , CD81 , EWI- 2 wint , TEM ABSTRACT Between 2 and 3 percent of the world population is chronically infected with hepatitis C virus ( HCV ) and thus at risk of developing liver cancer . Although precise mechanisms regulating HCV entry into hepatic cells are still unknown , several cell surface proteins have been identified as entry factors for this virus . Among these molecules , tetraspanin CD81 is essential for HCV entry . A major characteristic of tetraspanins is their ability to interact with each other and with other transmembrane proteins , thus building membrane multi-molecular complexes , collectively referred to as the tetraspanin enriched microdomains ( TEM ) . Estes são os imprescindíveis We identified a partner of CD81 , EWI- 2 wint , which inhibits HCV infection . We also analyzed the role of TEM-associated CD81 fraction in HCV infection . During the first part of this work , we showed that EWI- 2 wint , a new CD81 partner , is expressed in several cell lines but not in hepatocytes . Ectopic expression of EWI- 2 wint in Huh- 7 , a hepatoma cell line susceptible to HCV infection , blocked viral entry by inhibiting the interaction between CD81 and the HCV envelope glycoproteins present on the surface of viral particles . This finding suggests that , in addition to the presence of specific entry factors in the hepatocytes , the lack of a specific inhibitor can contribute to the hepatotropism of HCV . This is the first example of a pathogen gaining entry into host cells that lack a specific inhibitory factor . In parallel of this study , successive infections of Huh- 7 target cells with highly infectious HCV particles produced in cell culture allowed us to isolate cellular clones exhibiting different HCV infection levels . One of these cellular clones was resistant to HCV infection and had lost CD81 expression ( Huh- 7 w 7 cells ) . Ectopic expression of human CD81 ( hCD 81 ) in Huh- 7 w 7 cells restored HCV permissivity . Il y a des êtres humains qui luttent un moment , et c' est bien ; We then took advantage of these permissive cells expressing mCD 81 and the previously described MT 81 / MT 81w monoclonal antibodies to analyze the role of the TEM-associated CD81 in HCV infection . We showed that MT 81w antibody that only recognizes TEM-associated mCD 81 did not inhibit HCV infection and cholesterol depletion , which inhibits HCV infection , did not affect TEM-associated CD81 levels . Similarly , sphingomyelinase treatment , which also reduces HCV infection , raised TEM-associated CD81 levels . In summary , we showed that HCV entry is directly related to CD81 expression level in hepatoma cells and populations of CD81 associated with TEM do not seem to participate in the early steps of HCV life cycle . Keywords : HCV , entry process , tetraspanin , CD81 , EWI- 2 wint , TEM Liste des abréviations 3 ' NC & 226;& 128;& 147; extrémité 3 ' non codante 5 ' NC & 226;& 128;& 147; extrémité 5 ' non codante Des êtres qui luttent un certain temps , et c' est mieux ; ALAT & 226;& 128;& 147; alanine amino-transférase , transaminase hépatique ASAT & 226;& 128;& 147; aspartate amino-transférase , transaminase hépatique ARFP & 226;& 128;& 147; protéine F issue d' un cadre alternatif de lecture ( de l' anglais Alternating Reading Frame Protein ) BCR & 226;& 128;& 147; récepteur des cellules B ( de l' anglais B cell receptor ) CSP & 226;& 128;& 147; protéine circumsporozoïte du parasite Plasmodium ( de l' anglais circumsporozoite protein ) CDV & 226;& 128;& 147; virus de la maladie de Carré ( de l' anglais canine distemper virus ) C-terminal & 226;& 128;& 147; carboxy-terminal CLDN- 1 , - 6 , - 9 & 226;& 128;& 147; protéine des jonctions serrées , claudine- 1 , - 6 et - 9 CLDNs & 226;& 128;& 147; les claudines - 1 , - 6 et - 9 DARC & 226;& 128;& 147; récepteur de chemokines ( de l' anglais duffy antigen receptor for chemokines ) DC-SIGN & 226;& 128;& 147; lectine de type C ( de l' anglais dendritic cell specific ICAM- 3- grabbing nonintegrin ) EIAs & 226;& 128;& 147; essais immunoenzymatiques ( de l' anglais enzyme immunoassays ) Endo-H - enzyme endoglycosidase H EGF & 226;& 128;& 147; facteur de croissance épidermique ( de l' anglais epidermal growth factor ) EST & 226;& 128;& 147; banque de séquences ( de l' anglais Expressed sequence tag ) ERM & 226;& 128;& 147; protéines Ezrine , Radixine et Moesine ffu & 226;& 128;& 147; unité formant des foyers ( de l' anglais forming foci unit ) GAG & 226;& 128;& 147; glycosaminoglycanes GDD & 226;& 128;& 147; motif Gly-Asp-Asp , caractéristique des ARN polymérases ARN-dépendantes GFP & 226;& 128;& 147; protéine verte fluorescente ( de l' anglais green fluorescent protein ) GL & 226;& 128;& 147; gouttelettes lipidiques HB-EGF & 226;& 128;& 147; facteur de croissance épidermique lié à l' héparine ( de l' anglais heparin-binding epidermal growth factor ) HDL & 226;& 128;& 147; lipoprotéines de haute densité ( de l' anglais high density lipoproteins ) HTLV- 1 & 226;& 128;& 147; virus de la leucémie humaine de cellules T ( de l' anglais human T-cell leukemia virus ) HSP & 226;& 128;& 147; protéine de choc thermique ( de l' anglais heat shock protein ) HVR & 226;& 128;& 147; région hypervariable 1 , 2 et 3 ( de l' anglais hypervariable region ) IFN- ( ? , ? ) - interféron ? , ? Ig - immunoglobuline IRES & 226;& 128;& 147; site interne d' entrée des ribosomes ( de l' anglais internal ribosome entry site ) ISG & 226;& 128;& 147; gènes stimulés par interféron ( de l' anglais interferon-stimulated genes ) JFH- 1 & 226;& 128;& 147; de l' anglais Japanese Fulminant Hepatitis , génome du VHC de génotype 2a LDL & 226;& 128;& 147; lipoprotéines de faible densité ( de l' anglais low density lipoproteins ) LDL-R & 226;& 128;& 147; récepteur aux lipoprotéines de faible densité ( de l' anglais LDL-receptor ) LEL & 226;& 128;& 147; large boucle extracellulaire de la tétraspanine CD81 ( de l' anglais large extracellular loop ) LPL & 226;& 128;& 147; Lipoprotéine lipase L-SIGN & 226;& 128;& 147; lectine de type C ( de l' anglais liver / lymph node specific ICAM- 3- grabbing nonintegrin ) M ? CB & 226;& 128;& 147; méthyl- ? -cyclodextrine MHC-I et - II & 226;& 128;& 147; complexes majeurs d' histocompatibilité ( de l' anglais major histocompatibility complex ) MLV & 226;& 128;& 147; virus de la leucémie murine ( de l' anglais murine leukemia virus ) MT 81w & 226;& 128;& 147; anticorps monoclonal de rat anti-souris CD81 , qui reconnaît cette molécule uniquement lorsqu' elle est associée à la toile de tétraspanines MTP & 226;& 128;& 147; protéine de transfert microsomal NK & 226;& 128;& 147; cellules Natural Killer , composantes du système immunitaire inné N-terminal & 226;& 128;& 147; amino-terminal NS & 226;& 128;& 147; protéines non-structurales du virus de l' hépatite C OMS & 226;& 128;& 147; Organisation Mondiale de la Santé ORF & 226;& 128;& 147; cadre ouvert de lecture ( de l' anglais open reading frame ) PBMC & 226;& 128;& 147; cellules mononucléaires du sang périphérique ( de l' anglais peripherial blood mononuclear cells ) PKA & 226;& 128;& 147; protéine kinase A PKC & 226;& 128;& 147; protéine kinase C RE & 226;& 128;& 147; réticulum endoplasmique RFLP & 226;& 128;& 147; identification de variantes génétiques par l' utilisation d' enzymes de restriction formant des fragments avec des tailles différentes selon les génotypes et soustypes du VHC ( de l' anglais restriction fragment length polymorphism ) RT-PCR & 226;& 128;& 147; transcription reverse suivie d' une réaction en chaîne de la polymérase ( de l' anglais reverse transcription - polymerase chain reaction ) SAA & 226;& 128;& 147; lipoprotéine serum amyloïde A SCID - immunodéficience sévère combinée ( de l' anglais severe combined immunodeficiency ) sE 2 & 226;& 128;& 147; ectodomaine soluble de la glycoprotéine E2 du VHC SEL & 226;& 128;& 147; petite boucle extracellulaire de la tétraspanine CD81 ( de l' anglais small extracellular loop ) Smase & 226;& 128;& 147; enzyme sphingomyélinase SPP & 226;& 128;& 147; peptidase de peptide signal , enzyme cellulaire qui clive la protéine de capside ( de l' anglais signal peptide peptidase ) SR-BI & 226;& 128;& 147; scavenger récepteur de classe B type I SV40 & 226;& 128;& 147; virus simien 40 ( de l' anglais simian virus 40 ) TCR & 226;& 128;& 147; récepteur de cellules T ( de l' anglais T cell receptor ) TEM & 226;& 128;& 147; microdomaines enrichis en tétraspanines ( de l' anglais tetraspanin enriched microdomains ) TGF- ? - facteur ? de croissance de tumeur ( de l' anglais tumor growth factor- ? ) Th & 226;& 128;& 147; lymphocyte T auxiliaire ( de l' anglais T helper ) TIMP- 1 & 226;& 128;& 147; protéine inhibitrice des métalloprotéases ( de l' anglais tissue inhibitor of metalloproteinases ) TLR & 226;& 128;& 147; récepteurs toll-like ( de l' anglais toll-like receptors ) TMD & 226;& 128;& 147; domaine transmembranaire ( de l' anglais transmembrane domain ) TRAP & 226;& 128;& 147; protéine anonyme associée à la thrombospondine , du parasite Plasmodium ( de l' anglais thrombospondin-related anonymous protein ) VCAM- 1 - molécule vasculaire d' adhésion cellulaire- 1 ( de l' anglais vascular cell-adhesion molecule ) VIF & 226;& 128;& 147; virus de l' immunodéficience féline VHC & 226;& 128;& 147; virus de l' hépatite C VHCcc & 226;& 128;& 147; VHC produit en culture cellulaire VHCpp & 226;& 128;& 147; particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines d' enveloppe du VHC VIH & 226;& 128;& 147; virus de l' immunodéficience humaine VLDL & 226;& 128;& 147; lipoprotéines de très faible densité ( de l' anglais very low density lipoproteins ) VLP & 226;& 128;& 147; particules ressemblant au VHC ( de l' anglais virus-like particles ) INTRODUCTION I. L' Hépatite C 1 . La découverte de l' agent responsable de la maladie Pendant les années 70 , l' incidence des hépatites A et B post-transfusionnelles était en baisse due aux mesures de prévention , néanmoins un grand nombre de cas ne présentant aucun marqueur sérologique spécifique aux virus hépatotropes connus à l' époque était encore détecté . Pour cela , l' expression « hépatite post-transfusionnelle non-A non-B » a été proposée afin de décrire une forme d' hépatite qui n' était pas liée aux infections par le virus de l' hépatite A ni celui de l' hépatite B ( Lemon , 2007 ) . La première référence à un virus pouvant être l' agent étiologique de ces hépatites post-transfusionnelles non-A non-B a été publiée en 1974 ( Prince et al. , 1974 ) . La nature virale de l' agent infectieux a été finalement établie à la fin des années 70 grâce à des études d' infection expérimentale de chimpanzés ( Alter et al. , 1978a ; Bradley et al. , 1981 ; Tabor et al. , 1978 ) . Avec le succès de ces infections , Choo et collaborateurs ont décrit le clonage moléculaire d' une souche virale isolée à partir d' un chimpanzé infecté ( Choo et al. , 1989 ) . Leur étude a permis d' identifier les caractéristiques moléculaires de l' agent infectieux viral , sans que celui -ci n' ait été isolé ou cultivé . Ce virus a été appelé Virus de l' Hépatite C ( VHC ) et la maladie qu' il cause , Hépatite C . 2 . L' épidemiologie 2.1 . La prévalence de l' infection à travers le monde Selon l' Organisation Mondiale de la Santé ( OMS ) , environ 2 , 2 % de la population mondiale , soit 130 millions d' individus , sont infectés par le VHC ( Lemon , 2007 ) . L' hépatite C est une maladie chronique grave avec une prévalence variable d' un continent à l' autre . Dans les pays développés , les taux de prévalence des anticorps anti-VHC sont généralement inférieurs à 2 % . La France , par exemple , présente une prévalence estimée à 1 % de la population générale ( Bastie et al. , 1995 ; Dubois et al. , 1997 ; Martinot-Peignoux et al. , 1999 ; Payan et al. , 2005 ) . Par contre , dans certains pays , comme l' Egypte ( Memon and Memon , 2002 ) ou certaines régions de l' Italie ( Raffaele et al. , 2001 ) , la prévalence peut atteindre 20 % ( Figure 1 ) . Figure 1 . La prévalence du VHC à travers le monde . ( d' après WHO , Wkly . Epidemiol . Rec . 2002 ) . 2.2 . Les modes de contamination La transmission du VHC est essentiellement parentérale . Avant le développement des tests sérologiques pour le tri des donneurs de sang , les transfusions de sang et de ses dérivés , ainsi que la transplantation d' organes , étaient les principales voies de transmission du VHC . Actuellement , dans les pays développés , la majorité des cas sont associés à la toxicomanie intraveineuse ( Lemon , 2007 ) . En effet , la prévalence des anticorps anti-VHC varie de 30 % à 98 % dans la population toxicomane européenne ( Roy et al. , 2002 ) . L' incidence annuelle de contamination entre les toxicomanes par voie intraveineuse varie entre 15 % et 30 % . Par contre , dans la population générale la moyenne d' incidence de séroconversion anti-VHC à partir d' une exposition accidentelle au sang contaminé est de 1 , 8 % . Chez les professionnels de la santé , ce taux n' est pas très différent , il varie de 1 % à 2 % ( Lemon , 2007 ) . Dans les pays en développement , plusieurs cas d' infection sont corrélés à des injections thérapeutiques et aux transfusions de sang réalisées dans des mauvaises conditions d' asepsie . D' autres pratiques , telles que l' acupuncture , le tatouage ou le piercing , peuvent également représenter un risque de transmission si elles ne sont pas réalisées dans de bonnes conditions d' asepsie ( Lemon , 2007 ) . En effet , la contamination nosocomiale relève essentiellement de l' utilisation de matériel mal désinfecté . Les transmissions par voie périnatale , sexuelle ou familiale sont relativement peu fréquentes ( Lemon , 2007 ) . Il est à noter que pour 30 à 40 % des personnes infectées , aucune voie de contamination n' a été identifiée . 3 . Les techniques de diagnostic Le sérum ou plasma des patients est utilisé pour le diagnostic de l' infection par le VHC . Celui ci est réalisé par des techniques sérologiques , de détection d' anticorps dirigés contre les protéines virales , et par des techniques de biologie moléculaire , de détection d' acides nucléiques viraux . Les tests sérologiques utilisés sont des tests immunoenzymatiques ( EIAs ) , basés sur la technique d' immunoblot ou sur la détection d' anticorps spécifiques contre les différents génotypes du virus ( Pawlotsky , 1999 ) . Ces anticorps sont les marqueurs indirects d' une infection par le VHC et sont détectables à partir de sept ou huit semaines après l' infection . Il existe différents tests commerciaux de ce type , basés sur la détection d' anticorps dirigés contre différentes protéines virales ( capside , NS4 et NS5 , principalement ) ( Berenguer , 2002 ) . Ces tests sont très sensibles et permettent l' analyse d' un grand nombre d' échantillons . En général , les résultats positifs doivent être confirmés par la détection du génome viral . L' ARN génomique est le marqueur qui apparait le plus rapidement après la contamination . Les tests moléculaires pour la détection du génome ARN du VHC sont très importants pour le diagnostic des cas d' hépatite aiguë , mais aussi pour la confirmation d' une hépatite chronique après détection d' anticorps anti-VHC et pour contrôler la réponse à une thérapie antivirale . Ces tests sont également réalisés en cas d' exposition du personnel soignant au sang et pour la démonstration d' une transmission périnatale du VHC ( Pawlotsky , 2002 ) . Les méthodes de biologie moléculaire incluent des tests qualitatifs pour la détection de l' ARN viral présent dans les fluides corporels , et des tests quantitatifs pour la détermination de la charge virale . Ces derniers sont importants pour la détermination indirecte du niveau de réplication virale dans le foie ( Lemon , 2007 ) . Différentes techniques de détection de l' ARN génomique sont utilisées , comme la RT-PCR ( transcription reverse suivie d' une réaction en chaîne de la polymérase ) . Cependant , l' utilisation clinique des tests quantitatifs est réservée au suivi de la réponse à une thérapie antivirale . En plus de la détection et quantification de l' ARN viral , des techniques moléculaires sont disponibles pour déterminer le génotype du VHC , notamment chez les patients candidats à une thérapie antivirale . Il existe des techniques de séquençage direct de la région 5 ' non codante du génome et d' amplification de séquences codantes de la protéine de capside avec des oligonucléotides spécifiques pour les différents génotypes ( Lemon , 2007 ) . Une autre technique utilisée est l' identification de variants génétiques par l' utilisation d' enzymes de restriction , qui génèrent des fragments de tailles différentes selon les génotypes et sous-types ( RFLP & 226;& 128;& 147; polymorphisme de fragments d' enzymes de restriction ) ( Anderson et al. , 2003 ; Thiers et al. , 1997 ) . 4 . La pathogenèse de l' infection Le foie est l' organe majeur de réplication du VHC . Dans les tissus collectés de patients infectés , entre 5 à 50 % des hépatocytes présentent de l' ARN viral et des protéines virales ( Nouri-Aria et al. , 1995 ; Pal et al. , 2006 ) . Chez quelques patients , presque toutes les cellules hépatocytaires contiennent de l' ARN . Cependant , certaines études montrent que la présence du virus n' est pas limitée aux hépatocytes et que l' ARN et les antigènes peuvent être détectés dans les cellules mononuclées , dans l' épithélium biliaire , dans les cellules sinusoïdes et dans l' épithélium intéstinal ( Deforges et al. , 2004 ; Nouri-Aria et al. , 1995 ; Pal et al. , 2006 ) . L' ARN du VHC est détecté par RT-PCR dans les cellules mononuclées du sang périphérique ( PBMC ) , les ganglions , la rate , le cerveau , le pancréas , la moelle épinière , les glandes surénales et la thyroïde ( Forton et al. , 2004 ; Lerat et al. , 1998 ) . Par contre , il n' est pas connu si le virus se réplique réellement dans ces tissus . En culture cellulaire , il a été montré que le VHC est capable de se répliquer dans les cellules lymphoïdes ( Sung et al. , 2003 ) , avec la sélection de mutations d' adaptation ( Lerat et al. , 2000 ) . Figure 2 . Pathogenèse du VHC . 4.1 . L' évolution de la maladie et les symptômes cliniques L' hépatite C est une maladie progressive , la phase aiguë évolue vers une maladie chronique . A plus long terme , l' hépatite chronique peut causer une cirrhose et un hépatocarcinome ( Figure 2 ) . Plusieurs études ont montré que l' évolution chronique de cette maladie est fortement influencée par de nombreux facteurs , comme l' âge , le sexe , la consommation d' alcool ou la co-infection avec le virus de l' hépatite B ou avec celui de l' immunodéficience humaine ( VIH ) ( Lemon , 2007 ) . Par ailleurs , toute affection hépatique préexistante est aggravée par l' hépatite C. Ainsi , par exemple , le cancer hépatique progresse plus rapidement chez les individus atteints d' une hépatite alcoolique et également porteurs du VHC ( Lemon , 2007 ) . 4.1.1 . L' hépatite C aiguë Après contamination par le VHC , le patient va développer une hépatite aigüe qui est le plus souvent asymptomatique et rarement diagnostiquée . La période d' incubation , établie par des études réalisées avec des patients infectés par transfusions sanguines , varie entre 2 et 26 semaines , avec une moyenne de 7 semaines ( Lemon , 2007 ) . Bien que la plupart des cas soit asymptomatique , environ 20 % des patients développent des symptômes caractéristiques d' une hépatite virale aiguë , tels que la fatigue , des nausées , des douleurs , une urine noircie ou un ictère . Ce tableau clinique est associé à une élévation des transaminases hépatiques ( ASAT , ALAT ) , souvent supérieures à 10 fois les valeurs normales , suivie d' une séroconversion ( Lemon , 2007 ) . Des études indiquent que de 15 % à 30 % des cas d' hépatite aiguë guérissent spontanément . Les cas d' hépatites fulminantes sont extrêmement rares . La plupart des individus infectés ( de 70 % à 85 % ) développent une virémie persistante , presque toujours asymptomatique . L' évolution vers la chronicité n' est pas toujours associée à une élévation des transaminases hépatiques ou à des dommages du tissu hépatique ( Lemon , 2007 ) . 4.1.2 . L' hépatite C chronique Le passage de l' hépatite aigüe à une maladie chronique dépend d' un certain nombre de facteurs , comme par exemple l' âge et le sexe masculin . D' autres facteurs , viraux , génétiques ou immunitaires , pourraient également jouer un rôle important . L' infection chronique se caractérise par la persistance de la réplication virale avec une présence durable de l' ARN viral dans le sérum . De la même manière que l' hépatite aiguë , la forme chronique ne présente pas de symptômes spécifiques . Le plus souvent , l' individu manifeste une fatigue persistante et invalidante , mais les symptomes de la maladie hépatique n' apparaissent en général qu' après quelques décennies ( Lemon , 2007 ) . Malgré cela , la plupart des porteurs chroniques présentent des anomalies histologiques . Le stade de l' infection est normalement défini par une biopsie du foie , qui établit la gravité de l' atteinte du tissu hépatique , allant de l' inflammation vers la stéatose , la fibrose , puis la cirrhose , pour finir par le cancer . Les patients présentant une atteinte hépatique significative peuvent développer des complications graves . Néanmoins , le pronostic est difficile à prédire . L' hépatocarcinome , par exemple , est une complication tardive , apparaissant souvent à l' issue d' une cirrhose et se produisant typiquement après deux ou trois décennies d' infection persistante ( Lemon , 2007 ) ) . L' OMS estime qu' entre 10 et 20 % des porteurs chroniques développent une cirrhose , qui évolue en carcinome hépatocellulaire avec un taux de 5 % de cas par an ( OMS 2000 ) . Des évidences épidémiologiques fortes associent l' infection par le VHC au développement d' un hépatocarcinome . Néanmoins , comme tous les virus à ARN , le VHC se réplique exclusivement dans le cytoplasme , n' ayant aucun potentiel d' intégration du génome viral dans l' ADN cellulaire ( Lemon , 2007 ) . Ceci suggère que des méchanismes indirects contribuent au développement du cancer , incluant probablement l' état de cirrhose et d' inflammation prolongée , associés à un stress oxydatif avec un potentiel de dommage à l' ADN ( Okuda et al. , 2002 ) . De plus , il a été montré que certaines protéines du VHC pourraient être oncogènes . Par exemple , des souris transgéniques exprimant le gène de la capside du VHC développent non seulement une stéatose , mais également un cancer hépatique ( Moriya et al. , 1998 ; Moriya et al. , 2001 ) . Cette protéine semble d' ailleurs moduler l' action régulatrice de transcription de la protéine p 53 ( Kao et al. , 2004 ; Otsuka et al. , 2000 ) . D' autres protéines virales , notamment les protéines non structurales , pourraient être oncogènes ( Lerat et al. , 2002 ) . Il a été en effet montré que NS3 , NS5A et NS5B affectent la prolifération cellulaire ( Lemon , 2007 ) . 4.1.3 . Les manifestations extra-hépatiques Le VHC a été associé à plusieurs symptômes extrahépatiques , souvent d' origine immunologique ( pour revue ( Galossi et al. , 2007 ) . La cryoglobulinémie est la principale , présente chez 36 à 54 % des patients chroniques selon l' étude . Cette maladie est caractérisée par la présence de cryoglobulines , des immunoglobulines ( Ig ) anormales qui précipitent lors d' une exposition au froid . Elle est parfois associée à des problèmes rénaux ( glomérulonéphrites ) , cutanés ( purpura - lésion hémorragique au niveau de la peau ou des muqueuses ) , articulaires , ainsi qu' à certaines manifestations neurologiques ( pour revue ( Lemon , 2007 ; Saadoun et al. , 2007 ; Sansonno et al. , 2007 ) . Par ailleurs , le traitement de base contre le VHC , l' interféron- ? ( IFN- ? ) , est potentiellement inducteur d' auto-immunité et peut aggraver certaines pathologies . Néanmoins , le nombre réduit d' individus infectés développant des manifestations auto-immunitaires , suggère que l' auto-immunité serait restreinte à un sous-groupe de patients prédisposés ( Guadalupe Ercilla and Vinas , 2000 ) . 4.2 . La réponse immunologique de l' hôte et la persistance virale La qualité de la réponse immunitaire est essentielle pour l' élimination ou la persistance de l' infection par le VHC ( Figure 3 ) . L' élimination des antigènes viraux exige l' activation des réponses immunitaires humorale ( les lymphocytes B ) et cellulaire ( les lymphocytes T ) . Les lymphocytes T auxiliaires ( Th ) CD 4 + jouent un rôle important dans les fonctions immunorégulatrices à travers la modulation de la différentiacion des lymphocytes B et de l' activation des lymphocytes T cytotoxiques CD 8 + . Certains groupes de cellules Th CD 4 + , qui produisent de l' IFN- ? , participent à la défense contre les parasites intracellulaires , comme les virus , et stimulent l' action de cellules T cytotoxiques CD 8 + . Ces dernières détruisent les cellules infectées par des virus . Jusqu'à présent , les déterminants de l' immunité contre le VHC démeurent inconnus , néanmoins les études sur des chimpanzés et des humains présentant une guérison spontanée ont montré que la clairance virale est associée à une réponse T CD 8 + forte et durable , ciblant plusieurs épitopes du VHC ( Bowen and Walker , 2005 ; Racanelli and Manigold , 2007 ) . La reconnaissance des épitopes par les complexes majeurs d' histocompatibilité , les MHC-I et II , a permis leur identification . Les plus fréquents sont présents dans les protéines de capside et les protéines non structurales ( Day et al. , 2002 ; Gerlach et al. , 2005 ; Penna et al. , 2002 ; Schirren et al. , 2000 ; Schulze zur Wiesch et al. , 2005 ) . Néanmoins , il n' est pas encore établi si cette reconnaissance est liée à une présentation préferentielle par les cellules présentatrices d' antigènes de ces protéines , par rapport aux protéines d' enveloppe qui sont plus variables ( Lemon , 2007 ) . La clairance du VHC est également associée à une réponse T CD 4 + élevée . En effet , les individus séropositifs sains présentent des réponses plus fortes que celles des patients avec une hépatite chronique . Inversement , l' hépatite chronique est associée à des réponses T CD 4 + faibles ( Figure 3 ) ( Botarelli et al. , 1993 ; Valiante et al. , 2000 ) . Néanmoins , une réponse forte ne signifie pas forcément l' élimination du virus . De plus , les individus et les chimpanzés qui ont guéri , présentent un grand nombre de cellules de mémoire T CD 4 + et CD 8 + ( Bassett et al. , 2001 ; Day et al. , 2002 ; Day et al. , 2003 ; Lauer et al. , 2004 ; Major et al. , 2002 ; Shoukry et al. , 2003 ; Shoukry et al. , 2004 ; Takaki et al. , 2000 ) . D' un autre côté , les individus et les chimpanzés qui présentent une absence de cellules T spécifiques du virus possèdent un plus grand risque de développer une maladie chronique ( Cooper et al. , 1999 ; Gerlach et al. , 1999 ; Gruner et al. , 2000 ; Lauer et al. , 2002 ; Thimme et al. , 2002 ; Thimme et al. , 2001 ) . La plupart des individus infectés par le VHC développent des réponses T CD 4 + et T CD 8 + pendant la phase aiguë de la maladie , mais elles sont anormalement lentes , même lorsqu' il y a guérison spontanée ( Figure 3 ) ( Lemon , 2007 ) . Dans ce sens , il a été montré que durant l' infection primaire de chimpanzés , les cellules T CD 8 + spécifiques contre le VHC apparaissent relativement tard , elles sont détectables de 5 à 10 semaines après l' infection ( Cooper et al. , 1999 ; Lechner et al. , 2000 ; Shoukry et al. , 2003 ; Thimme et al. , 2002 ; Urbani et al. , 2005 ) . Ce qui suggère que les antigènes du VHC ne sont pas accessibles au système immunitaire et ne sont pas présentés aux cellules T pendant presque deux mois . Le système immunitaire pourrait ne pas « sentir » les virus jusqu'à ce que l' infection soit relativement avancée ( Racanelli and Manigold , 2007 ; Racanelli and Rehermann , 2003 ) . Figure 3 . Représentation schématique de la réponse immunitaire cellulaire au cours de l' infection aiguë par le VHC . ( d' après Bowen & Walker , Nature 205 ) A ) La virémie ( en rouge ) est présente rapidement et , bien qu' elle diminue après le pic , n' est jamais contrôlée . Il s' ensuit l' établissement d' une infection chronique avec une virémie variable chez les différents patients . Dans ces conditions , les réponses CD 4 + et CD 8 + ( en noir et en vert , respectivement ) ainsi que le niveau des transaminases sériques ( en bleu ) évoluent peu et peuvent être faibles voire absentes . B ) La virémie persiste pendant plusieurs semaines en absence de réponse immunitaire cellulaire détectable . L' apparition des réponses CD 4 + et CD 8 + est associée à un contrôle temporaire de la virémie ainsi qu' à des variations du niveau des transaminases sériques . Toutefois , après la chute de la réponse CD 4 + , la virémie réapparaît et devient persistante . Une réponse CD 8 + peut rester détectable malgré l' infection chronique . C ) Bien que la virémie apparaisse rapidement et que les réponses cellulaires apparaissent tardivement , le virus devient indétectable dans le plasma après l' apparition des cellules CD 4 + et CD 8 + qui coïncide souvent avec un niveau de transaminases sériques variable . Un rebond de la virémie peut avoir lieu avant la clairance virale . Les lymphocytes T CD 8 + sont , par ailleurs , spécialement présents dans le foie des porteurs chroniques ( Figure 3 ) ( Erickson et al. , 1993 ; Erickson et al. , 2001 ; Grabowska et al. , 2001 ; He et al. , 1999 ; Koziel et al. , 1993 ; Koziel et al. , 1992 ; Nelson et al. , 1998 ; Spangenberg et al. , 2005 ; Wong et al. , 1998 ; Wong et al. , 2001 ) . Cependant , ils ne sont probablement pas complètement fonctionnels ( Appay et al. , 2002 ; Gruener et al. , 2001 ; Lucas et al. , 2004 ; Wedemeyer et al. , 2002 ) . De plus , il a été montré que la protéine de capside possède un rôle suppresseur immunitaire sur la prolifération des cellules T et probablement sur leur différentiation ( Accapezzato et al. , 2004 ; Hahn , 2003 ) . L' expression de la capside pourrait également augmenter la résistance des hépatocytes à la cytolyse médiée par les cellules T , le principal mécanisme de mort cellulaire dans le foie ( Disson et al. , 2004 ; Kamegaya et al. , 2005 ; Yin and Ding , 2003 ) . La persistance de l' infection par le VHC a également été associée à une altération de l' activité des cellules Natural Killer ( NK ) . En effet , chez les patients présentant une maladie chronique les niveaux d' expression de récepteurs des cellules NK sont réduits . Inversement , chez les patients qui ont réussi à éliminer le virus par la thérapie antivirale , les niveaux d' expression étaient comparables à ceux observés chez les individus sains ( Nattermann et al. , 2006 ) . De plus , il a été montré qu' en interagissant avec la protéine CD81 , la protéine d' enveloppe E2 du VHC est capable de bloquer l' activation des cellules NK et d' inhiber la production d' IFN- ? par ces cellules ( Crotta et al. , 2002 ; Tseng and Klimpel , 2002 ) . Toutefois , la persistance de l' infection n' a pas encore été corrélée à une activité cytotoxique défectueuse ou à une production d' IFN- ? déficiente par ces cellules ( Golden-Mason and Rosen , 2006 ; Koziel , 2006 ) . Pour que les lymphocytes T puissent reconnaître et répondre spécifiquement à un antigène ils doivent être stimulés par d' autres cellules , les cellules présentatrices d' antigènes , telles que les cellules dendritiques et les phagocytes mononucléaires . Bien que les cellules dendritiques soient permissives à l' infection par plusieurs virus , leur capacité à supporter la réplication du génome viral est souvent inférieure à celle d' autres types cellulaires . Ceci suggère que l' importance de l' infection de ces cellules par les virus est plutôt de cibler les fonctions de présentation d' antigènes que de produire de nouveaux virus ( Pachiadakis et al. , 2005 ) . En ce qui concerne le VHC , il a été montré que des patients peuvent présenter des monocytes et des PBMC infectés ( Lerat et al. , 1998 ; Muratori et al. , 1996 ) . Certaines études ont détecté le génome du VHC dans des cellules dendritiques , dérivées de monocytes isolés à partir du sang périphérique de patients infectés ( Bain et al. , 2001 ; Navas et al. , 2002 ) . D' autres ont montré que les porteurs chroniques possèdent un nombre réduit de cellules dendritiques , qui parfois présentent des déficiences fonctionnelles , pouvant causer une mauvaise présentation d' antigènes aux cellules T ( Golden-Mason and Rosen , 2006 ; Pachiadakis et al. , 2005 ) . Les lymphocytes B , les cellules productrices d' anticorps , peuvent également être stimulés directement par des antigènes viraux . D' ailleurs , la cryoglobulinémie associée au VHC peut évoluer vers un lymphome Non-Hodgkinien de cellules B. D' autre part , l' infection par le VHC entraîne la production d' anticorps dirigés contre les protéines virales chez la majorité des patients chroniquement infectés . Des anticorps neutralisants ont d' ailleurs été détectés dans les sérums de patients infectés , les principales cibles étant la protéine d' enveloppe E2 présente à la surface de la particule virale ( Bartosch et al. , 2003a ; Farci et al. , 1994 ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005a ; Logvinoff et al. , 2004 ; Meunier et al. , 2005 ; Yu et al. , 2004 ) . Des anticorps dirigés contre la région hypervariable 1 ( HVR1 ) de E2 ont montré , par exemple , une activité neutralisante in vitro et in vivo ( Farci et al. , 1996 ; Shimizu et al. , 1996 ) . De plus , différentes études suggèrent que chez les patients qui éliminent le virus , la clairance virale est associée à l' induction rapide de la production d' anticorps neutralisants dans la phase précoce de l' infection et/ou à une réduction de la diversification de l' épitope HVR1 ( Lavillette et al. , 2005a ; Mondelli et al. , 2003 ; Pestka et al. , 2007 ) . Par contre , le rôle des anticorps neutralisants dans le contrôle de l' infection est remis en question par le fait que la réinfection est possible en leur présence et qu' ils sont également détectés dans les sérums de patients chroniquement infectés ( Farci et al. , 1992 ; Lemon , 2007 ) . Le VHC est également capable de moduler les défenses anti-virales des cellules infectées , c' est à dire les voies de signalisation cellulaires qui mènent à la synthèse d' interférons de type 1 et à d' autres gènes stimulés par l' interféron ( ISG ) , qui ont un potentiel antiviral . Il semblerait que les protéines du VHC , particulièrement NS3 / 4A , bloquent ces voies de signalisation ( Foy et al. , 2003 ; Gale and Foy , 2005 ; Loo et al. , 2006 ) . En effet , la protéase virale NS3 / 4A bloque les voies de signalisation normalement activées par la présence d' ARN double brin dans le cytoplasme , car elle clive des protéines cellulaires nécessaires à la transduction de signal ( Lemon , 2007 ) . Par contre , il n' est pas encore bien établi si cette évasion des voies de signalisation de l' interféron contribue à l' établissement d' une infection persistante ( Gale and Foy , 2005 ) . D' autres études suggèrent que les protéines de capside , E2 et NS5A , pourraient également moduler certaines voies de signalisation ( Gale et al. , 1997 ; Heim et al. , 1999 ; Hosui et al. , 2003 ; Miller et al. , 2004 ; Pflugheber et al. , 2002 ) . Le réseau de ces interactions contribuerait à l' évasion des réponses antivirales cellulaires , en rendant le virus relativement résistant aux actions antivirales de l' IFN et à d' autres protéines activées par les ARN double brin ( Lemon , 2007 ) . En résumé , pendant la phase aiguë de l' infection , il a été proposé que les anticorps neutralisants , les cellules Th et les cellules cytotoxiques étaient critiques pour la clairance du VHC . Il est probable , que tous ces effecteurs de la réponse immunitaire jouent des rôles majeurs dans la résolution de la maladie . Par contre , pendant la phase chronique , la situation est différente parce que le virus s' est déjà établi dans l' hôte et continue à survivre aux attaques continues du système immunitaire . Les mécanismes d' échappement à la réponse immunitaire de l' hôte développés par le VHC démeurent méconnus ( Lemon , 2007 ) . Des modèles cellulaires indiquent que certaines protéines virales possèdent des rôles inhibiteurs et suppresseurs des cellules T régulatrices . En effet , la protéine d' enveloppe E2 présentant des variations dans la séquence HVR1 pourrait inhiber les réponses T CD 4 + spécifiques contre le virus ( Frasca et al. , 1999 ) . Par ailleurs , l' introduction de mutations aléatoires dans le génome viral induit l' émergence de variants d' échappement , lorsque elles ont lieu sur des épitopes soumis aux pressions de sélection du système immunitaire ( Lemon , 2007 ) . Ces mutations facilitent l' échappement à la reconnaissance de cellules infectées par les cellules T CD 8 + ( Bowen and Walker , 2005 ) . Pendant la phase chronique , le génome viral présente une diversification limitée , qui est probablement liée à une génération détériorée de cellules T CD 8 + ( Lemon , 2007 ) . Des mutations dans leurs épitopes MHC-I sont en effet sélectionnées pendant les infections chez l' homme et chez le chimpanzé ( Bowen and Walker , 2005 ; Cox et al. , 2005 ; Erickson et al. , 2001 ; Ray et al. , 2005 ; Tester et al. , 2005 ; Timm et al. , 2004 ) . Néanmoins , quelques populations de cellules T pourraient ne jamais atteindre le seuil nécessaire pour exercer une pression sélective significative ( Lemon , 2007 ) . D' autres hypothèses ont été proposées : un haut niveau de réplication du VHC pourrait causer l' épuisement du système immunitaire à travers la production de quantités énormes d' antigènes ; la suppression de l' expansion des cellules Th spécifiques du VHC ; l' induction de l' apoptose des cellules T CD 8 + spécifiques dirigées contre le virus ; et l' accumulation de mutations portées par les protéines d' enveloppe ( Lemon , 2007 ) . Une autre hypothèse en lien avec les protéines d' enveloppe est que leur niveau de glycosylation pourrait moduler l' immunogénicité des particules virales et ainsi restreindre l' accès des anticorps neutralisants à la surface des virions ( Helle et al. , 2007 ) . 5 . Les traitements L' importance du génotypage du VHC chez les patients chroniquement infectés vient du fait que , selon le génotype du virus , la durée et la réponse au traitement peuvent varier . Aujourd'hui , le traitement de référence est basé sur l' utilisation de l' IFN- ? pégylé associé à la ribavirine , un analogue nucléosidique de la guanosine ayant un effet antiviral sur de nombreux virus . La prévention de l' infection répose uniquement sur la réduction ou l' élimination des risques de transmission , car malheureusement il n' existe pas encore de vaccin contre l' hépatite C . La durée de la thérapie varie entre 6 et 12 mois selon le génotype viral . En général , les patients chroniquement infectés avec les génotypes 2 et 3 suivent un traitement pendant 6 mois avec une faible dose de ribavirine . Parmi ces patients , de 76 % à 82 % des individus présentent une réponse virologique prolongée , c' est-à-dire l' absence de détection de l' ARN viral dans le sérum six mois après la fin du traitement . En revanche , seulement 42 % à 46 % des patients infectés par le génotype 1 , traités pendant 12 mois avec une forte dose de ribavirine , possèdent une élimination permanente du virus ( Lemon , 2007 ; Poynard et al. , 2003 ) . En plus d' un taux élevé de non-répondeurs , ces traitements sont longs , coûteux et peuvent donner lieu à des effets secondaires non négligeables , tels qu' une neutropénie , une perte de poids , des nausées , un syndrome grippal ( fièvre , myalgies , frissons ) et un état dépressif . Sans compter qu' ils sont contre-indiqués dans un certain nombre de cas , comme la grossesse , l' insuffisance rénale sévère , l' hépatite auto-immune , entre autres ( Fried , 2002 ) . Pour cela , il est essentiel d' identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l' hépatite C . A l' heure actuelle , plusieurs molécules sont en phase clinique . Certaines d' entre elles visent à améliorer le traitement actuel . C' est le cas de l' Albuferon-alpha et de la Viramidine , qui sont en phase III . L' Albuferon-alpha corresponds à l' IFN fusionné à l' albumine , ce qui lui confère une demi-vie plus longue que l' IFN pégylé . La Viramidine est un précurseur de la ribavirine avec son effet anti-VHC , mais sans l' effet hémotylique induit par le traitement avec cette molécule . D' autres composants ciblent spécifiquement le virus , ce qui devrait rendre le traitement plus spécifique et moins toxique ( De Francesco and Migliaccio , 2005 ; Huang et al. , 2006 ; Pawlotsky et al. , 2007 ) . C' est en effet le cas de la molécule VX- 950 ( telaprevir ) , une molécule mimant la région carboxy-terminale ( C-terminale ) de NS3 et capable de bloquer cette protéase virale . Le telaprevir présente une activité importante dans le système de réplicons et il possède des effets antiviraux chez les patients infectés ( Forestier et al. , 2007 ; Reesink et al. , 2006 ) . De manière intéressante , la combinaison du telaprevir avec de l' IFN- ? et de la ribavirine induit un effet antiviral encore plus efficace ( Lawitz et al. , 2008 ) . Certains patients ont présenté le développement de variants de résistance à la molécule , mais ils démeurent sensibles au traitement avec l' IFN- ? et la ribavirine ( Lawitz et al. , 2008 ; Sarrazin et al. , 2007a ) . Plusieurs études ont donné des résultats encourageants quant à l' utilisation de vaccins comme traitement prophylactique contre le VHC . Un essai de vaccination a été réalisé chez le chimpanzé avec des hétérodimères des glycoprotéines virales E1E2 purifiés ( Ralston et al. , 1993 ) . Cet antigène permettait la production d' anticorps ainsi qu' une réponse immunitaire cellulaire de type Th dirigée contre les protéines d' enveloppe E1 et E2 ( Choo et al. , 1994 ) . Plusieurs approches de vaccination sont en essai clinique pour une utilisation en complément aux traitement existants ( Houghton and Abrignani , 2005 ) . Des données préliminaires suggèrent que la réponse au traitement IFN / ribavirine est étroitement liée à la réponse immunitaire cellulaire ( Cramp et al. , 2000 ; Nelson et al. , 1998 ; Vrolijk et al. , 2003 ) et à la réponse immunitaire humorale , avec des anticorps probablement dirigés contre les protéines d' enveloppe ( Baumert et al. , 2000 ) . Il semble donc possible d' amplifier la réponse immunitaire par une vaccination appropriée afin d' améliorer le taux de réponse de la thérapie standard . L' utilisation d' un antigène E1 en présence d' un adjuvant à base d' alun permet par exemple d' amplifier les réponses immunitaires humorale et cellulaire dirigées contre E1 chez les patients virémiques ( Nevens et al. , 2003 ) . En outre , l' anticorps monoclonal humain de haute affinité XTL- 002 dirigé contre la glycoprotéine E2 du VHC réduit de manière dose-dépendante les niveaux de VHC sériques dans le système de souris « VHC-Trimera » ( Ilan et al. , 2002 ) . Chez les patients qui ont reçu une dose intraveineuse de cet anticorps , la charge virale a également été réduite ( Bayes et al. , 2004 ) . II . Le virus de l' Hépatite C ( VHC ) 1 . La classification et la variabilité génomique Le génome du VHC présente des caractéristiques communes à d' autres virus à ARN simple brin de polarité positive . L' analyse des séquences clonées a montré des similitudes avec les virus appartenant aux genres Flavivirus ( comme les virus de la Fièvre Jaune et de la Dengue ) et Pestivirus ( comme le virus de la Diarrhée Bovine ) , tous appartenant à la famille des Flaviviridae ( Miller and Purcell , 1990 ) ( Figure 4 ) . Des analyses ultérieures ont permis la classification du VHC dans un genre séparé , l' Hepacivirus ( Houghton , 1996 ) . Un autre groupe de virus qui appartient à cette famille comprend les agents GB , nommés GBV-A , - B et -C ( Karayiannis and McGarvey , 1995 ) . Le GBV-B est un virus hépatotrope qui présente une forte identité de séquence avec le VHC ( Ferron et al. , 2005 ) . Figure 4 . Arbre phylogénétique de la famille des Flaviviridae . ( d' après Ferron et al. , BMC Informatics 2005 ) La présence du VHC chez les populations humaines a produit un grand nombre de variants ou génotypes distincts , numérotés de 1 à 6 . Chaque génotype possède plusieurs sous-types qui sont désignés par des lettres ( Simmonds et al. , 1993 ) ( Figure 5 ) . Les génotypes diffèrent entre eux de 31 % à 33 % au niveau de leurs séquences nucléotidiques . La variation est de 20 % entre les sous-types et d' un peu moins de 10 % dans chaque sous-type ( Pawlotsky , 2003 ; Simmonds , 1995 ; Simmonds , 2004 ) . Figure 5 . Arbre phylogénétique réalisé à partir des séquences codantes complètes des différents génotypes du VHC . ( d' après la base de données sur le VHC de Los Alamos , Etats-Unis ) 1.1 . L' émergence et la diversification des génotypes Cette variabilité génomique est le résultat de l' accumulation de mutations dans le génome pendant le processus de réplication virale . Le VHC , comme les autres virus à ARN , réplique son matériel génétique en utilisant une ARN polymérase ARN-dépendante . Cette enzyme introduit des erreurs au hazard lors de la réplication et , à l' inverse de l' ADN polymérase , elle ne possède pas la capacité de correction de ses erreurs de lecture . En effet , la fréquence d' erreurs de l' ARN polymérase ARN-dépendante du VHC est de l' ordre de 10 - 4 à 10 - 5 par position nucléotidique ( Domingo et al. , 2006 ; Pawlotsky , 2003 ) . Ce qui permet une sélection naturelle rapide des virions adaptés aux nouveaux environnements chez les différents hôtes . Comme la production de particules virales par les cellules infectées est très importante , environ 1012 virions par jour ( Neumann et al. , 1998 ) , les erreurs de réplication s' accumulent et génèrent une diversité génétique au sein de chaque individu infecté , ce qui conduit à l' apparition de quasi-espèces . Tandis que des mutations resteraient silencieuses par la conservation des mêmes acides aminés , certaines conduiraient à la synthèse de génomes défectifs , produisant des virions non viables . D' autres enfin conféreraient un avantage ou un handicap sélectif selon l' environnement dans lequel le virus évolue . L' accumulation de mutations pourrait aboutir à des changements de la biologie virale pouvant conduire par exemple à l' augmentation de la sensibilité à la réponse immunitaire ou à l' emergence de virions plus résistants . 1.2 . La distribution mondiale des génotypes Les génotypes du VHC se répartissent d' une façon variée entre les différentes régions géographiques du monde ( Figure 6 ) . Par exemple , l' Europe et l' Amérique du Nord présentent plusieurs génotypes avec une nombre restreint de sous-types . Dans ces pays , les sous-types 1a , 1b , 2a , 2b et 3a sont les plus fréquents et l' existence d' autres génotypes serait due aux immigrations ou voyages récents dans des pays lointains ( Smith and Simmonds , 1997 ) . D' autres régions sont caractérisées par l' existence de plusieurs sous-types d' un seul génotype prédominant . Cela est observé en Guinée pour le génotype 1 ; dans certaines régions de l' Afrique Centrale et de l' Est pour le génotype 2 ; en Inde pour le génotype 3 ; en Afrique Centrale pour le génotype 4 ; et en Asie du Sud-est pour le génotype 6 . Une région endémique pour le génotype 5 n' a pas encore été identifiée , mais il est possible qu' elle soit l' Afrique du Sud , parce que c' est le seul endroit où ce génotype est très commun ( Smith et al. , 1997 ) . Figure 6 . Distribution géographique des différents génotypes du VHC . ( d' après Zein , Clin . Microbiol . Rev . 2000 ) L' origine de la variation génotypique du VHC est incertaine . Ces variants pourraient être récents , issus d' une dissémination epidémique au travers de nouvelles voies de transmission au sein de la population humaine en croissance ; ou alors , ils pourraient être beaucoup plus anciens , résultant d' une présence continue du virus dans une population isolée . Des études ont identifié le taux de substitution par site nucléotidique et par an , indiquant qu' un ancêtre commun à tous les génotypes aurait existé il y a environ 500 ans ( Smith et al. , 1997 ) . Néanmoins , tandis que quelques génotypes sont ubiquitaires , d' autres sont isolés dans des régions géographiques particulières , où une extrême diversité de sous-types existe . Cette distribution est plutôt une conséquence d' une longue période d' infection endémique , pendant laquelle il n' y a pas eu d' échange avec les génotypes d' autres régions . La transmission virale s' est produite continuellement par des voies parentérales issues des pratiques culturelles spécifiques et/ou par des voies verticales , sexuelles et familiales . Le temps de divergence des génotypes du VHC pourrait alors précéder considérablement les voies modernes de transmission parentérale ( Smith et al. , 1997 ) . Ainsi , la grande diversité de sous-types d' un seul génotype dans une population donné signale que l' infection est endémique depuis une longue période de temps , pouvant aller de 500 à 2000 ans . Inversement , la grande dissémination d' un génotype avec peu de variété de sous-types , comme le 1b en Europe , met en évidence l' introduction relativement récente de ce variant ( Mellor et al. , 1995 ; Smith et al. , 1997 ) . Par ailleurs , le fait que les génotypes 1b , 2a et 2b soient présents dans presque toutes les régions du monde pourrait être liée à des interventions médicales , telles que le vaccin contre la fièvre jaune contenant du sérum humain , l' utilisation de seringues non-stérilisées et ré-utilisées pour les injections , la vaccination contre la variole , etc ( Smith et al. , 1997 ) . 1.3 . Les génotypes et la pathogenèse de la maladie Le rôle des génotypes du VHC dans la progression de la maladie est particulièrement controversé ( Zein , 2000 ) . Certaines études suggèrent que le génotype 1b pourrait être associé à une atteinte hépatique plus sévère et à une évolution plus aggressive de la maladie que les autres génotypes . Par contre , d' autres études réfutent ces associations . D' une manière générale , le génotype viral ne semble pas influencer le taux de passage à la chronicité , la sévérité des lésions hépatiques ou le développement de manifestations extra-hépatiques . Cependant , la stéatose hépatocytaire est induite directement par le VHC de génotype 3 , suggérant que certaines séquences virales induisent l' accumulation intracellulaire de lipides ( Hui et al. , 2002 ; Rubbia-Brandt et al. , 2004 ; Rubbia-Brandt et al. , 2001 ; Rubbia-Brandt et al. , 2000 ; Westin et al. , 2002 ) . Au cours des infections causées par d' autres génotypes , la stéatose semble être principalement métabolique ( Bjornsson and Angulo , 2007 ; Negro , 2006 ) . Ce dommage tissulaire est marqué par l' accumulation de gouttelettes lipidiques ( GL ) de plusieurs tailles dans le cytoplasme cellulaire ( Moriya et al. , 1997 ) . La protéine de capside , principalement de génotype 3 , semble jouer un rôle dans le développement de la stéatose ( Barba et al. , 1997 ; Boulant et al. , 2006 ; Hope and McLauchlan , 2000 ; Rubbia-Brandt et al. , 2000 ) et elle se retrouve à la surface de ces GL ( Hope et al. , 2002 ; Rouille et al. , 2006 ) . Il a été montré que son expression dans les cellules hépatocytaires induit la présence de GL présentant un volume significativement plus grand ( Piodi et al. , 2008 ) . Cette étude a également montré que ces grandes GL sont présentes en plus grand nombre dans les cellules exprimant la protéine de capside de génotype 3a . Toutefois , Piodi et collaborateurs n' ont pas observé de différences significatives entre les séquences issues de patients infectés par le VHC de ce génotype et présentant ou non une stéatose . Ceci suggère que d' autres protéines virales pourraient agir directement ou moduler la fonction de la protéine de capside , ou alors que des facteurs de l' hôte déterminaraient si la réplication du VHC de génotype 3a déclenche la formation et la croissance des GL ( Piodi et al. , 2008 ) . 2 . Les propriétés biophysiques de la particule virale Le VHC est un virus enveloppé sphérique de 55 à 65 nm de diamètre ( Kaito et al. , 1994 ) . Il est constitué d' une nucléocapside d' environ 30 nm de diamètre et d' une enveloppe lipidique dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 ( Figure 7A ) . De nombreuses études ont permis de déterminer que le VHC circule sous différentes formes dans le sang des patients infectés . Ces diverses formes présentent une distribution hétérogène dans un gradient de densité . La plupart des sérums analysés présentent deux populations majeures , les particules de faible ( 1 , 03 & 226;& 128;& 147; 1 , 08 g / mL ) et de haute densité ( 1 , 17 & 226;& 128;& 147; 1 , 25 g / mL ) ( Andre et al. , 2002 ; Prince et al. , 1996 ) . Les particules de haute densité sont associées à des Ig et sont peu infectieuses ( Choo et al. , 1995 ; Hijikata et al. , 1993 ; Maillard et al. , 2001 ) . D' un autre côté , celles de faible densité résultent de l' association avec des lipoprotéines de très faible ou de faible densité ( VLDL et LDL ) ( Andre et al. , 2002 ; Monazahian et al. , 2000 ; Nielsen et al. , 2006 ) . Il semblerait que les particules les plus infectieuses aient une densité comprise entre 1 , 09 et 1 , 11 g / mL ( Bradley et al. , 1991 ; Hijikata et al. , 1993 ) . Une étude récente a montré que la production virale par les hépatocytes était dépendante de l' assemblage et de la sécrétion des VLDL , suggèrant que les particules du VHC seraient liées ou incorporées aux VLDL durant leur assemblage et seraient ensuite sécrétées avec ces lipoprotéines ( Huang et al. , 2007 ) . Dans ce sens , il a été montré que les particules du VHC sont assemblées dans un compartiment intracellulaire sous forme de particules de forte densité ( > 1 , 15g / mL ) , mais qu' elles acquièrent des éléments qui leur confèrent une faible densité ( < 1 , 14g / mL ) durant leur sécrétion ( Gastaminza et al. , 2006 ) . Enfin , une autre étude a décrit une forme de virions de faible densité , nommée lipo-viro-particule ( Andre et al. , 2002 ) . Ces particules sont riches en triglycérides et contiennent au moins les apolipoprotéines B et E , l' ARN du VHC et la protéine virale de capside . Elles sont également associées à des IgG et IgM . Figure 7 . A ) Représentation schématique d' une particule du VHC . B ) Organisation génomique du VHC . Des études sur l' inactivation des particules virales ont été réalisées au début des années 80 , à l' époque où l' hépatite C était encore appelée hépatite non-A non-B. Ces études ont montré que l' agent des hépatites non-A non-B était inactivé par des traitements au chloroforme ( Feinstone et al. , 1983 ) , à la formaline au 1 / 1000 ( Yoshizawa et al. , 1982 ) , par irradiation avec des rayons ultra-violet ( Prince et al. , 1985 ) et par chauffage à 100 °C pendant 1 heure ( Yoshizawa et al. , 1982 ) ou à 60 °C pendant 10 heures ( Hollinger et al. , 1984 ) . Néanmoins , des études plus approfondies seraient nécessaires pour confirmer les conditions capables d' inactiver ce virus . 3 . L' organisation du génome Le génome du VHC est constitué d' un ARN simple brin de polarité positive de 9 , 6 kb environ ( Choo et al. , 1989 ) avec un cadre ouvert de lecture ( ORF ) , encadré par deux extrémités non-codantes ( 5 ' NC et 3 ' NC ) . L' ORF code une polyprotéine d' environ 3000 acides aminés ( Reed and Rice , 2000 ) ( Figure 7B ) . 3.1 . Les extrémités non codantes 3.1.1 . La région 5 ' non codante La région 5 ' non codante ( 5 ' NC ) , importante pour la réplication du génome viral et la traduction des protéines virales , est très conservée parmi les différents isolats du VHC ( Honda et al. , 1999 ) . Ce segment génomique est essentiel à la traduction de la polyprotéine et à la réplication du génome . Elle est constituée de 341 nucléotides et comporte quatre domaines distincts , de I à IV ( Figure 7B ) . Des signaux critiques pour la réplication du génome sont localisés dans les domaines I et II ( nucléotides 1 à 115 ) , mais la séquence entière de la région 5 ' NC est nécessaire à une réplication efficace de l' ARN ( Friebe et al. , 2001 ; Kim et al. , 2002 ) . Les domaines II à IV ( nucléotides 44 à 341 ) ainsi que le début de la séquence de l' ORF contiennent un site interne d' entrée des ribosomes ( IRES ) . L' IRES est capable de se lier à la sous-unité ribosomal 40S avec une grande affinité et en absence des facteurs de transcription canoniques , d' une manière similaire aux ARN messagers procaryotes ( Honda et al. , 1996 ; Pestova et al. , 1998 ) . Cette sous-unité ribosomale , associée au facteur de transcription eIF 3 , se fixe sur la partie basale du domaine III rapprochant ainsi le complexe d' initiation du codon AUG d' initiation qui se trouve au sein du domaine IV ( Sarnow , 2003 ; Siridechadilok et al. , 2005 ) . La région 5 ' NC est une bonne cible pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques . Des études d' inhibition de la traduction par des ARN interférents dirigés contre cette région ont en effet été publiées ces dernières années ( Kanda et al. , 2007 ; Prabhu et al. , 2006 ; Ray and Das , 2004 ) . Par ailleurs , Jopling et collaborateurs ont montré qu' un micro-ARN ( miR- 122 ) , spécifiquement exprimé dans les hépatocytes humains , facilite la réplication de l' ARN viral en interagissant avec la région 5 ' NC du génome viral ( Jopling et al. , 2005 ) . 3.1.2 . La région 3 ' non codante La région 3 ' non codante ( 3 ' NC ) , de taille variable ( environ 250 nucléotides ) , présente trois régions distinctes : une séquence peu conservée de 40 à 50 nucléotides ; une zone poly-uracile / pyrimidine ( poly ( U / UC ) ) de longueur variable ; et une séquence très conservée de 98 nucléotides . Celle -ci joue un rôle important dans l' initiation de la synthèse du brin d' ARN négatif au cours de la réplication ( Kolykhalov et al. , 1996 ) . La stabilité de la structure de la région 3 ' NC semble être importante pour la réplication virale ( Friebe and Bartenschlager , 2002 ) . D' autre part , cette région pourrait favoriser la traduction du génome viral ( Murakami et al. , 2001 ; Song et al. , 2006 ) . En effet , il semblerait que la région 3 ' NC est capable de stimuler l' acitivité de l' IRES du VHC , augmentant la traduction du génome viral . 3.2 . Les protéines virales Figure 8 . Les protéines du VHC et leur association avec la membrane du RE. ( d' après Moradpour et al. Nature Reviews Microbiology 2007 ) Le génome du VHC présente un ORF codant une polyprotéine d' environ 3000 acides aminés , qui est synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique ( RE ) et subit différents clivages co- et post-traductionnels ( Figures 7B et 8 ) . Les clivages C / E 1 , E1 / E2 , E 2 / p 7 , et p 7 / NS2 sont assurés par des peptidases signal d' origine cellulaire ( Dubuisson et al. , 2002 ) . Le reste de la polyprotéine est clivé par deux protéases virales , NS2 et NS3 / 4A. Ainsi , la traduction de l' ORF aboutit à la formation d' au moins dix protéines matures : C , E1 , E2 , p 7 , NS2 , NS3 , NS4A , NS4B , NS5A et NS5B ( Figures 7B et 8 ) . Les protéines C , E1 et E2 sont dites « structurales » car elles sont associées aux virions , tandis que les protéines NS ( « non-structurales » ) joueraient un rôle dans le cycle viral . De plus , il a été décrit qu' un cadre de lecture alternatif chevauchant le début de la séquence de la protéine C code une onzième protéine , la protéine F . 3.2.1 . La protéine C La protéine de capside ou protéine C est l' élément protéique de la nucléocapside virale . Elle est très conservée et fortement antigénique ( Houghton et al. , 1991 ) . Cette protéine peut exister sous différentes formes . D' abord , un clivage à son extrémité C-terminale donne naissance à une forme « immature » , de 23 kDa et formée des 191 premiers acides aminés de la polyprotéine précurseur ( Santolini et al. , 1994 ) . Ensuite , l' action d' une peptidase de peptide signal ( SPP ) conduit à la forme dite « mature » d' environ 21 kDa ( McLauchlan , 2000 ; McLauchlan et al. , 2002 ) . Au sein de la protéine de capside , trois domaines fonctionnels ont été décrits ( Hope and McLauchlan , 2000 ) . Le domaine 1 ( acides aminés 1 à 118 ) constitue une région de liaison avec la région 5 ' NC du génome , permettant la formation de la nucléocapside . Le domaine 2 ( acides aminés 119 à 174 ) assure la maturation et la mise en conformation du domaine 1 ( Boulant et al. , 2005 ) , mais il est aussi important pour conférer les propriétés membranaires de la protéine . En effet , la capside est retrouvée au niveau des membranes , telles que celles du RE ( Figure 8 ) , mais elle est localisée majoritairement dans un compartiment associé aux GL des cellules infectées ( Rouille et al. , 2006 ) . Il a été d' ailleurs suggéré que l' interaction avec les GL pourrait affecter le métabolisme des lipides et contribuer au développement de la stéatose hépatique , surtout chez les patients infectés par le VHC de génotype 3 ( Asselah et al. , 2006 ) . Enfin , le domaine 3 ( acides aminés 175 à 191 ) sert de peptide signal pour le clivage entre C et E1 et pour l' adressage de E1 dans la lumière du RE ( Santolini et al. , 1994 ) . La protéine de capside pourrait intervenir dans la régulation de l' expression de certains gènes cellulaires ( Jackel-Cram et al. , 2007 ; Nguyen et al. , 2006 ; Sillanpaa et al. , 2008 ; Watashi and Shimotohno , 2003 ) , dans l' apoptose ( pour revue ( Fischer et al. , 2007 ) ) , dans la prolifération cellulaire ( Jin et al. , 2005 ; Sato et al. , 2006 ) et pourrait interférer avec le métabolisme lipidique ( Jarmay et al. , 2005 ; Jhaveri et al. , 2008 ; Kim et al. , 2007 ) . Cependant , certaines de ces fonctions sont encore controversées . 3.2.2 . La protéine F Parallèlement à la traduction de l' ORF , une petite protéine nommée protéine F ou ARFP ( protéine issue d' un cadre alternatif de lecture ) ( Branch et al. , 2005 ; Lo et al. , 1995 ; Lo et al. , 1994 ) est synthétisée . Son gène chevauche en partie celui de la protéine de capside . Des études dans des systèmes de réticulocytes de lapin indiquent que cette protéine est produite par un décalage du cadre de lecture - 2 / + 1 au niveau d' une séquence de glissement , les codons 8 - 11 de la séquence codant la protéine de capside ( Varaklioti et al. , 2002 ; Xu et al. , 2001 ) . D' autres études réalisées en culture cellulaire indiquent que des sites internes d' initiation de traduction existent dans les positions 26 et 85 - 87 de la séquence codant la protéine de capside ( Baril and Brakier-Gingras , 2005 ; Vassilaki et al. , 2008 ; Vassilaki and Mavromara , 2003 ) . La protéine F possède une taille variable en fonction du génotype étudié , mais ne dépasse pas 160 acides aminés ( Boulant et al. , 2003 ) . Sa localisation intracellulaire est périnucléaire ( Roussel et al. , 2003 ) , en association avec le RE ( Vassilaki et al. , 2008 ; Xu et al. , 2001 ) et sa demi-vie est estimée à dix minutes , car elle est dégradée par le protéasome ( Roussel et al. , 2003 ; Xu et al. , 2003 ) . Bien que sa fonction reste inconnue , son expression ne semble pas nécessaire à la réplication de l' ARN viral ( McMullan et al. , 2007 ) . Récemment , il a été suggéré que la protéine F jouerait un rôle transformant chez des patients infectés , via sa capacité à stimuler le proto-oncogène de c-myc ( Ma et al. , 2008 ) . De plus , il a été montré qu' elle pourrait avoir des fonctions immunomodulatrices ( Fiorucci et al. , 2007 ) . Certains patients présentent d' ailleurs des anticorps et une réponse immunitaire cellulaire anti-F ( Bain et al. , 2004 ; Komurian-Pradel et al. , 2004 ; Varaklioti et al. , 2002 ; Walewski et al. , 2001 ; Xu et al. , 2001 ) . 3.2.3 . Les protéines d' enveloppe E1 et E2 Un chapitre sur les protéines d' enveloppe du VHC est développé par la suite ( Cf partie III . 1 . ) . 3.2.4 . La protéine p 7 La protéine p 7 est constituée de 63 acides aminés ( 747 à 809 ) et se situe à la jonction entre les protéines structurales et non structurales ( Lin et al. , 1994 ) . La comparaison des séquences de p 7 de différents génotypes montre une relative variabilité des acides aminés , cependant l' organisation globale et la nature des résidus demeurent constantes ( Carrere-Kremer et al. , 2002 ) . La protéine p 7 possède deux domaines transmembranaires ( TMD ) , ancrés dans les membranes du RE ( Figure 8 ) et les extrémités N- et C-terminales sont dirigées vers la lumière du RE ( Carrere-Kremer et al. , 2002 ) . Elle est également retrouvée au niveau des membranes mitochondriales ( Carrere-Kremer et al. , 2002 ; Griffin et al. , 2005 ) . Des études indiquent que 7 aurait une activité de canal ionique au sein de membranes ( Griffin et al. , 2004 ; Pavlovic et al. , 2003 ; Premkumar et al. , 2004 ) , qu' elle est essentielle à l' infection du VHC chez les chimpanzés ( Sakai et al. , 2003 ) et qu' elle agit à une étape précoce de la morphogenèse des particules infectieuses ( Jones et al. , 2007 ) . Il a en effet été montré que la protéine p 7 est essentielle à l' assemblage et sécrétion efficace de virions infectieux ( Steinmann et al. , 2007 ) . 3.2.5 . La protéine NS2 La protéine NS2 ( acides aminés 810 à 1026 ) est une protéine transmembranaire non essentielle à la formation du complexe de réplication du VHC ( Blight et al. , 2000 ; Lohmann et al. , 1999 ) . Lorsque NS2 est exprimée seule , elle se retrouve associée aux membranes du RE ( Figure 8 ) ( Franck et al. , 2005 ) . NS2 forme avec le tiers amino-terminal ( N-terminal ) de NS3 une autoprotéase , qui assure le clivage entre NS2 et NS3 ( pour revue ( Lindenbach and Rice , 2005 ) ) . La structure du domaine catalytique de NS2 montre une protéase à cystéines , de forme dimérique , avec deux sites actifs ( Lorenz et al. , 2006 ) . Cette protéase nécessite une activation par la protéine chaperon cellulaire Hsp 90 ( Waxman et al. , 2001 ) . Bien que le rôle de NS2 ne soit pas connu , plusieurs fonctions lui ont été attribuées . Elle serait impliquée dans la phosphorylation de NS5A ( Liu et al. , 1999 ) et pourrait participer à la morphogenèse du VHC ( Jones et al. , 2007 ; Yi et al. , 2007 ) . Par ailleurs , des sites de recombinaison conduisant à la formation de virus infectieux chimériques intergénotypiques ont été cartographiés dans NS2 ( Legrand-Abravanel et al. , 2007 ; Lindenbach and Rice , 2005 ; Noppornpanth et al. , 2006 ; Pietschmann et al. , 2006 ) . 3.2.6 . Les protéines NS3 & 226;& 128;& 147; NS4A La protéine NS3 ( acides aminés 1027 à 1657 ) possède une double fonction enzymatique . Sa région N-terminale a une fonction sérine protéinase , alors que son extrémité C-terminale possède une activité hélicase et NTPase . La fonction sérine protéinase du tiers N-terminal de NS3 se rapproche de la famille des sérine protéinases de type chymotrypsine . Ce domaine de NS3 est associé au cofacteur NS4A ( acides aminés 1658 à 1711 ) , ce qui permet son stabilisation , car NS3 est dégradée rapidement en absence de NS4A. Cette association entre NS3 et NS4A assure l' activation des clivages entre NS3 / NS4A , NS4A / NS4B , NS4B / NS5A et NS5A / NS5B ( Lindenbach et al. , 2005 ) . De plus , elle permet l' interaction de NS3 avec la membrane du RE , puisque , contrairement à NS4A , NS3 ne possède pas de TMD ( Figure 8 ) . Quand NS3 est exprimée seule , elle se diffuse librement à travers la cellule ( Wolk et al. , 2000 ) . Le domaine hydrophobe N-terminal de NS4A est également nécessaire à l' adressage de NS3 dans le RE . L' extrémité C-terminale de NS3 code une hélicase à ARN ( Tai et al. , 1996 ) . Ces enzymes sont capables de dérouler des duplexes ARN-ARN . Il a été montré qu' une forme monomérique de NS3 est capable de lier l' ARN , mais que le déroulement des duplexes d' ARN nécessite un dimère ( Serebrov and Pyle , 2004 ) . L' activité hélicase est nécessaire à la réplication de l' ARN , mais l' étape précise n' est pas encore déterminée ( Lam and Frick , 2006 ) . Il serait possible que cette fonction soit active lors de l' initiation de la réplication de l' ARN , en déroulant les structures secondaires des brins positifs et négatifs de l' ARN viral . L' hélicase de NS3 pourrait également contribuer à la processivité du complexe de réplication en éliminant les structures secondaires internes et/ou en déplaçant les protéines liées à l' ARN . Il a d' ailleurs été décrit que NS3 peut interagir avec certaines protéines cellulaires ( Tellinghuisen and Rice , 2002 ) . Enfin , elle pourrait servir à dissocier la forme réplicative de l' ARN . Récemment , il a été proposé que NS3 pourrait être impliquée dans la carcinogenèse ( Deng et al. , 2006 ) . Par ailleurs , il semblerait que la protéase NS3 - 4A soit impliquée dans l' inhibition de la réponse antivirale innée chez les cellules infectées ( Evans and Seeger , 2006 ; Foy et al. , 2003 ) . Pour cela , elle est une bonne cible pour le développement de nouveaux antiviraux ( Chen and Tan , 2005 ; De Francesco and Migliaccio , 2005 ) . En effet , des peptides mimant la région C-terminale de NS3 sont capables de bloquer la protéase et d' inhiber des réplicons du VHC ( Lamarre et al. , 2003 ; Lin et al. , 2004b ; Malcolm et al. , 2006 ; Steinkuhler et al. , 1998 ) . Bien que plusieurs de ces molécules induisent l' apparition de mutations conférant une résistance dans ce système ( Lin et al. , 2005 ; Lin et al. , 2004a ; Yi et al. , 2006a ) , plusieurs essais cliniques sont actuellement en cours ( Huang et al. , 2006 ) , notamment avec le telaprevir , comme décrit précédemment . Une autre molécule , la SCH503034 , présente également une activité inhibitrice sur le système réplicon ( Malcolm et al. , 2006 ) , ainsi que chez l' homme , lors d' essais thérapeutiques chez des patients qui n' ont pas répondu au traitement à l' IFN- ? ( Huang et al. , 2006 ; Sarrazin et al. , 2007b ) . 3.2.7 . La protéine NS4B NS4B ( acides aminés de 1712 à 1972 ) est une protéine hydrophobe , associée aux membranes du RE ( Figure 8 ) ( Gretton et al. , 2005 ; Lundin et al. , 2003 ) . Elle présente quatre TMD et ses deux extrémités N- et C-terminales sont localisées dans le cytosol . Néanmoins , une fraction de l' extrémité N-terminale peut être détectée dans la lumière du RE ( Lundin et al. , 2003 ) . NS4B induit des modifications membranaires , suggérant qu' une de ses fonctions serait la formation de structures membranaires impliquées dans la réplication de l' ARN viral ( Egger et al. , 2002 ) . Toutefois , ces structures semblent légèrement différentes du réseau membranaire observé lorsque toutes les protéines virales sont exprimées , indiquant que d' autres protéines seraient également impliquées dans les modifications membranaires ( Einav et al. , 2004 ) . D' autres études suggèrent l' importance de cette protéine pour la réplication de l' ARN viral . En effet , NS4B possède un motif de liaison aux nucléotides et sa mutation affecte la réplication ( Einav et al. , 2004 ) . De plus , la palmitoylation de deux cystéines présentes à son extrémité C-terminale semble importante pour la formation du complexe de réplication ( Yu et al. , 2006 ) . Enfin , des variations de la séquence de NS4B semblent influencer l' efficacité de la réplication virale ( Blight , 2007 ) . 3.2.8 . La protéine NS5A NS5A ( acides aminés de 1973 à 2420 ) est une protéine ancrée dans les membranes du RE grâce à son domaine membranaire N-terminal ( Figure 8 ) ( Brass et al. , 2002 ; Penin et al. , 2004 ) . Elle est essentielle à la réplication du VHC ( Appel et al. , 2006 ; Seeger , 2005 ) et interagit avec NS5B , permettant le maintien de la réplication d' un réplicon subgénomique dans des cellules hépatocytaires Huh- 7 ( Shirota et al. , 2002 ) . Cette protéine est également capable de fixer l' ARN du VHC , qu' il s' agisse du brin négatif ou positif ( Huang et al. , 2005a ) . Des mutations qui améliorent la réplication de l' ARN viral en culture cellulaire ont été d' ailleurs cartographiées et certaines mutations réduisent la production de particules virales ( Appel et al. , 2005 ) . NS5A est naturellement phosphorylée et peut également être retrouvée sous forme hyperphosphorylée ( Tanji et al. , 1995 ) . La relevance de cette forme n' est pas connue , cependant des mutations qui réduisent son hyperphosphorylation conduisent à une forte augmentation de la réplication génomique du VHC ( Appel et al. , 2005 ; Evans et al. , 2004 ) . D' autres études ont montré que NS5A interagit avec différents composants de la voie de signalisation intracellulaire ( Reyes , 2002 ; Tellinghuisen and Rice , 2002 ) et qu' elle est capable d' inhiber l' induction de l' apoptose en interagissant avec certaines protéines cellulaires ( pour revue ( Fischer et al. , 2007 ) ) . Par ailleurs , sa surexpression induit une instabilité chromosomique qui est probablement impliquée dans le développement des hépatocarcinomes liés au VHC ( Baek et al. , 2006 ) . Enfin , NS5A est impliquée dans la régulation de la réponse à l' IFN ( Choi et al. , 2006 ; Machida et al. , 2006 ; Tan and Katze , 2001 ) . 3.2.9 . La protéine NS5B NS5B ( acides aminés 2421 à 3011 ) est une protéine membranaire qui assure la fonction d' ARN polymérase ARN-dépendante , présentant le motif Gly-Asp-Asp ( GDD ) caractéristique des ces enzymes ( Poch et al. , 1989 ) . Cette protéine possède un motif d' ancrage membranaire localisé à son extrémité C-terminale ( Ivashkina et al. , 2002 ) et elle est retrouvée au niveau des membranes du RE ( Figure 8 ) ( Schmidt-Mende et al. , 2001 ) . Son domaine fonctionnel enzymatique se trouve dans la région N-terminale ( Bressanelli et al. , 1999 ) et semble être modulé par des interactions avec d' autres protéines virales , telles que NS3 et NS5A ( Bartenschlager et al. , 2004 ) . La protéine NS5B joue un rôle prépondérant au sein du complexe de réplication du VHC . En effet , elle contribue à la synthèse d' ARN de polarité négative à partir du brin positif . L' ARN négatif est ensuite utilisé comme matrice pour la réplication du génome , aboutissant à un ARN de polarité positive . La structure tridimensionnelle de cette protéine révèle une forme de main droite classique avec des « doigts » , un « pouce » et une « paume » ( Bressanelli et al. , 2002 ; Bressanelli et al. , 1999 ) . Le domaine en forme de « paume » contient le site actif enzymatique alors que les « doigts » et le « pouce » forment un tunnel par lequel l' ARN est directement mené au site actif . Les nucléotides nécessaires à l' élongation de l' ARN en cours de synthèse arrivent au niveau du site actif en passant par un autre tunnel chargé positivement . L' importance de cette protéine pour le cycle viral fait d' elle une cible intéressante pour le développement de nouvelles molécules antivirales ( De Francesco and Migliaccio , 2005 ) . Elles peuvent appartenir à deux groupes : les analogues de nucléosides qui s' associent au site actif ( Bressanelli et al. , 2002 ; Olsen et al. , 2004 ) et les inhibiteurs allostériques non-nucléosidiques qui se lient à des sites distants du motif GDD ( Biswal et al. , 2005 ; Ma et al. , 2005 ; Nguyen et al. , 2003 ; Tomei et al. , 2004 ) . Les analogues de nucléosides inhibent l' élongation de l' ARN , alors que les inhibiteurs allostériques agissent en inhibant l' initiation de la synthèse de l' ARN ( Di Marco et al. , 2005 ) . Parmi les analogues de nucléosides capables d' inhiber la réplication des réplicons du VHC , le NM283 réduit de manière dose-dépendante la charge virale des patients traités pendant deux semaines . Des essais cliniques en combinaison avec de l' IFN pégylé indiquent une diminution de la charge virale dans une partie significative des patients ( De Francesco and Migliaccio , 2005 ; Huang et al. , 2006 ) . D' autres essais cliniques sont en cours avec des inhibiteurs allostériques capables d' inhiber la réplication du VHC en culture cellulaire ( Beaulieu and Tsantrizos , 2004 ; De Francesco and Migliaccio , 2005 ; Huang et al. , 2006 ) . Cependant , plusieurs molécules antivirales ciblant NS5B induisent l' apparition de mutations conférant une résistance dans le système réplicon ( Lin et al. , 2005 ; Lin et al. , 2004a ; Mo et al. , 2005 ; Nguyen et al. , 2003 ; Tomei et al. , 2004 ) . 4 . Les modèles d' étude Bien que le clonage du VHC ait permis une analyse rapide de son organisation génomique , ainsi qu' une caractérisation biochimique de ses protéines , l' absence de système de culture cellulaire permettant son amplification efficace a constitué pendant plus de quinze ans un obstacle majeur dans l' étude du cycle infectieux de ce virus . Ces dernières années , trois modèles ont permis des avancées : les réplicons sous-génomiques , les particules rétrovirales pseudotypées avec les protéines d' enveloppe du VHC ( VHCpp ) et le virus natif infectieux en culture cellulaire ( VHCcc ) . Pendant l' attente de ce dernier , différents modèles d' étude in vitro et in vivo ont été utilisés comme modèle de susbtitution pour l' étude : du cycle viral , des interactions du virus avec l' hôte ou de l' activité antivirale des molécules utilisées contre le VHC . 4.1 . Les modèles animaux Le VHC est un virus qui , dans la nature , infecte uniquement les humains . En effet , jusqu'à présent les scientifiques n' ont jamais détecté d' autre animal infecté par ce virus de manière naturelle . Expérimentalement , le chimpanzé est le seul animal infectable par le VHC de façon reproductible ( Alter et al. , 1978a ; Alter et al. , 1978b ; Tabor et al. , 1978 ) , pouvant développer des infections aiguës ou chroniques similaires à celles observées chez l' homme . Cela a conduit à la détermination des propriétés physicochimiques du VHC ( He et al. , 1987 ; Yuasa et al. , 1991 ) . Cependant , chez le chimpanzé , la sévérité de la maladie est souvent moins importante que chez l' homme et les réponses immunitaires semblent atténuées ( Bassett et al. , 1998 ; Bassett et al. , 1999 ) . Dans un premier temps , l' infection expérimentale des chimpanzés a été réalisée par inoculation intraveineuse de plasmas humains contaminés ( Bradley et al. , 1981 ; Bradley et al. , 1985 ; Gravelle et al. , 1982 ; Tabor et al. , 1978 ) ou par inoculation intrahépatique des ARN obtenus à partir des ADN complémentaires ( ADNc ) ( Kolykhalov et al. , 1997 ; Shimizu et al. , 1998 ; Yanagi et al. , 1997 ) . Récemment , avec le développement du système cellulaire permettant la production de particules virales , il a été montré que le chimpanzé peut être infecté par ces virions produits en culture cellulaire ( Wakita et al. , 2005 ) . Ces virions infectieux issus de chimpanzés infectés ont préferentiellement une densité d' environ 1 , 09 g / mL ( Lindenbach et al. , 2006 ) . Le problème de l' utilisation de ce modèle pour l' étude du VHC est que le chimpanzé est un animal rare , protégé et son entretien est coûteux . De plus , l' Union Européenne interdit son utilisation à des fins expérimentales . Des tentatives d' infection d' autres primates , comme le marmouset ( Feinstone et al. , 1981 ) , le tamarin ( Karayiannis et al. , 1983 ) et un mammifère proche des primates , le tupaïa ( Xie et al. , 1998 ) , ont abouti à une virémie intermittente ou transitoire , sans développement d' une maladie associée . Néanmoins , une étude a montré que l' infection d' hépatocytes primaires de tupaïa par des plasmas humains contaminés par le VHC entraîne une virémie et une faible production de particules virales infectieuses in vitro ( Zhao et al. , 2002 ) . Les modèles animaux incluent également l' utilisation de souris . Le rôle des protéines du VHC dans la pathogenèse de la maladie a été analysé chez des souris transgéniques exprimant ces protéines ( Lerat et al. , 2002 ) . Cependant , ces animaux ne sont pas naturellement susceptibles à l' infection et des souris humanisées ont été développées . Ces animaux présentent une immunodéficience sévère combinée ( souris SCID ) et sont porteurs d' un transgène activateur de plasminogène ( Alb-uPA ) , ce qui conduit à une destruction de leur foie , recolonisé par des cellules de foie humain . L' infection de ces souris par des sérums humains contaminés par le VHC a permis d' établir une infection persistante et la production de particules virales infectieuses ( Mercer et al. , 2001 ) . D' autres travaux , consistant à greffer du foie humain contaminé chez des souris immunodéficientes , nommées « VHC-trimera » , ont permis de retrouver , de manière transitoire , des particules virales dans le sang des souris et d' évaluer l' effet de molécules antivirales anti-VHC sur leur charge virale ( Ilan et al. , 2002 ) . Cependant , ces modèles de souris sont très lourds à mettre en place et les animaux nécessitent une intervention chirurgicale très délicate . 4.2 . Les modèles cellulaires 4.2.1 . Les cellules infectées par du VHC isolé de sérums de patients Les hépatocytes sont considérés comme la cible naturelle du VHC in vivo . Pour cela , des hépatocytes primaires humains ou de chimpanzés ont été utilisés pour essayer d' établir un système d' infection efficace du VHC . Ces cellules ont été infectées par des sérums de patients atteints d' hépatite C chronique ( Castet et al. , 2002 ; Fournier et al. , 1998 ; Iacovacci et al. , 1997 ; Lanford et al. , 1994 ; Molina et al. , 2007 ; Molina et al. , 2008 ; Rumin et al. , 1999 ) . Une étude a également porté sur la mise en culture de cellules provenant du foie de patients chroniquement infectés par le VHC ( Ito et al. , 1996 ) . Néanmoins , dans tous ces essais , la réplication et la propagation virales étaient faibles . De plus , ces systèmes sont peu reproductibles et il est extrêmement difficile de se procurer des foies humains en bonne santé . Par ailleurs , la permissivité des hépatocytes primaires au virus est transitoire et varie en fonction du donneur , car il dépend du titre viral et de la capacité du virus à se complexer à des Ig ou à des lipoprotéines présentes dans le sérum . Ces paramètres expérimentaux étant peu contrôlables , cette méthode d' étude est difficilement standardisable . D' autres essais ont été réalisés en infectant des cellules mononuclées du sang avec des sérums de patients infectés ( Cribier et al. , 1995 ) . Ces essais ont confirmé que le VHC se réplique dans ces cellules , mais les taux de production virale étaient trop faibles pour que ce modèle serve à l' étude du cycle viral . Une autre méthode était l' utilisation de lignées cellulaires stables . La plupart de ces essais consistaient en l' utilisation de surnageant de culture d' une lignée transfectée par des ARN du VHC , pour infecter des cellules naïves de cette même lignée . Malgré la réplication de l' ARN viral dans ces systèmes , la production de particules virales restait cependant très faible ( Aizaki et al. , 2003 ; Ikeda et al. , 1998 ) . Une de ces études a réussi à montrer que même les lignées lymphocytaires T ( MOLT- 4 et MT- 2 ) et B ( Daudi ) seraient permissives à la réplication du VHC ( Shimizu et al. , 1992 ) . 4.2.2 . Les systèmes d' expression hétérologue des protéines structurales De nombreux systèmes d' expression des protéines du VHC ont été utilisés dans le but de mieux comprendre leurs fonctions . Ils reposaient sur la transfection de lignées cellulaires par des constructions plasmidiques , l' infection ou la transduction de cellules par un virus recombinant . Ces derniers ont l' avantage de permettre la production d' une grande quantité de protéines de qualité satisfaisante . Dans ce sens , les propriétés vectorielles des virus de la vaccine ou du virus Sindbis ont été utilisées pour synthétiser les protéines structurales du VHC en cellules hépatocytaires HepG 2 ( Dubuisson et al. , 1994 ) . De même , ces protéines ont été exprimées en cellules de mammifère en utilisant un vecteur adénovirus ( Seong et al. , 1998 ) . Un outil clé pour l' identification de molécules réceptrices du VHC a été les formes solubles de la glycoprotéine E2 ( Figure 9A ) . La région TMD de ces protéines a été délétée ( Michalak et al. , 1997 ) , car elle contient des signaux de rétention à la membrane du RE et d' hétérodimérisation ( Figure 12 ) ( Cocquerel et al. , 2000 ; Dubuisson et al. , 2000 ; Op De Beeck et al. , 2000 ) , des propriétés qui rendaient leur purification difficile . Figure 9 . Modèles d' étude de l' entrée du VHC dans les cellules cibles in vitro . A ) Les deux formes solubles de l' ectodomaine de la glycoprotéine d' enveloppe E2 ( sE 2 ) tronquées au niveau des acides aminés 715 et 611 sont représentées schématiquement . B ) Le système de production de pseudoparticules rétrovirales du VHC ( VHCpp ) repose sur la co-transfection des HEK-293T avec un vecteur d' expression qui code les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 du VHC sous contrôle du promoteur du cytomégalovirus ( CMV ) ; un vecteur exprimant les protéines codées par les gènes gag et pol d' un rétrovirus , MLV ou VIH ; et un troisième qui contient des séquences rétrovirales nécessaires à la transcription reverse , à l' encapsidation et à l' intégration du gène rapporteur luciférase ou GFP dans l' ADN génomique de la cellule infectée ( LTR , pour long terminal repeat ; PBS , pour primer binding site ; PPT , pour polypurine track ) . L' infection des cellules cibles est détectée par la mesure de l' activité luciférase ou de l' intensité de fluorescence . C ) Les particules du VHC en culture cellulaire ( VHCcc ) sont produites par transfection du génome JFH- 1 ( génotype 2a ) dans des cellules hépatiques Huh- 7 . La séquence codant les protéines structurales peut être remplacée par celle d' autres génotypes . Un gène rapporteur luciférase est parfois intégré dans la portion N-terminale de la protéine de capside ( C ) permettant de quantifier l' infection virale . Deux formes solubles de E2 ( sE 2 ) sont généralement utilisées : une forme tronquée en position 715 ( s E2 - 715 ) juste en amont du TMD et l' autre en position 661 ( s E2 - 661 ) ( Figure 9A ) . La forme E2 - 661 est la mieux exprimée et présente certaines caractéristiques fonctionnelles de la protéine native ( Flint et al. , 2000 ; Michalak et al. , 1997 ) . Elle a servi à l' identification de protéines cellulaires de surface impliquées dans l' entrée du VHC , telles que CD81 ( Pileri et al. , 1998 ) , le récepteur scavenger classe B de type I ( SR-BI ) ( Scarselli et al. , 2002 ) et l' héparane sulfate ( Barth et al. , 2003 ) . Bien que sE 2 ait constitué un outil très utile pour étudier l' attachement du VHC , elle ne présente pas une conformation fidèle de E2 associée à la particule virale ( Brazzoli et al. , 2005 ; Cocquerel et al. , 2003b ; Drummer et al. , 2006 ; Owsianka et al. , 2001 ; Zhang et al. , 2004a ) . Les glycoprotéines E1 et E2 ont tendance à mal se replier et à former des agrégats lorsqu' elles ne sont pas associées à la membrane . De plus , Flint et collaborateurs ont montré que la forme s E2 - 661 ne reflète pas les hétérodimères présents à la surface des VHCpp et VHCcc impliqués dans l' attachement à CD81 ( Flint et al. , 2006 ) . 4.2.3 . Les pseudo-virions et virosomes Une autre méthode consistait à utiliser des baculovirus recombinants , exprimant l' ensemble des protéines structurales du VHC , pour produire , en cellules d' insecte , du matériel particulaire ressemblant à des particules du VHC ( VLP ) ( Baumert et al. , 1998 ; Choi et al. , 2004 ) . Plusieurs études ont analysé l' interaction de ces VLP avec les cellules cibles ( Chapel et al. , 2006 ; Fipaldini et al. , 1999 ; Jeong et al. , 2004 ; Martyn et al. , 2007 ; Matsuo et al. , 2006 ; McCormick et al. , 2002 ; Saunier et al. , 2003 ) . Cependant , il est important de noter que les cellules d' insecte possèdent une voie de glycosylation différente de celle des cellules de mammifères , et que la glycosylation de E1 et E2 est très importante non seulement pour le repliement correct de ces protéines , mais également pour l' entrée virale ( Goffard et al. , 2005 ) . D' autres études ont rapporté l' obtention de virus pseudotypés du virus de la stomatite vésiculaire exprimant des glycoprotéines recombinantes E1 et E2 du VHC ( Buonocore et al. , 2002 ; Lagging et al. , 1998 ; Matsuura et al. , 2001 ) . Cependant , ces protéines E1 et E2 recombinantes ne possèdaient pas leur TMD et il a été montré qu' ils sont importants pour l' hétérodimèrisation de E1E2 et pour l' entrée virale ( Ciczora et al. , 2005 ; Cocquerel et al. , 1998 ) . Une approche alternative pour analyser les phases précoces de l' entrée virale était l' incorporation des protéines d' enveloppe E1 et E2 dans des vésicules lipidiques de type liposomes ( Lambot et al. , 2002 ) . Néanmoins , ces virosomes sont difficiles à préparer , ils ne sont pas infectieux et les protéines d' enveloppe présentes à leur surface ne suivent pas la voie de sécrétion classique , n' étant donc pas correctement maturées . Enfin , un système utilisant des réplicons du virus de la forêt de Semliki exprimant les protéines de structure du VHC a été utilisé pour étudier les étapes initiales du bourgeonnement ( Blanchard et al. , 2002 ) . Par la suite , il a permis d' étudier le rôle de la capside dans la formation des particules virales et de visualiser la formation des particules dans le RE ( Roingeard et al. , 2004 ) . Néanmoins , ce système ne permet pas non plus la production de particules infectieuses . 4.2.4 . Les particules rétrovirales pseudotypées avec E1 et E2 du VHC Les particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines d' enveloppe du VHC ( VHCpp ) sont des virus chimériques recombinants constitués du corps viral du virus de la leucémie murine ( MLV ) ou du VIH , des glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 du VHC et d' un gène rapporteur codant la protéine verte fluorescente ( GFP ) ou la luciférase ( Bartosch et al. , 2003c ; Drummer et al. , 2003 ; Hsu et al. , 2003 ) . Ces particules s' auto-assemblent dans les cellules embryonnaires humaines HEK-293T après transfection de trois vecteurs d' expression : le premier exprime les glycoprotéines E1 et E2 natives , le deuxième exprime les protéines codées par les gènes gag et pol du MLV ou du VIH ( matrice , capside , protéase , réverse-transcriptase et intégrase ) et le troisième exprime le gène rapporteur , qui sera le seul à être encapsidé dans la nucléocapside rétrovirale et intégré dans le génome cellulaire ( Figure 9B ) . Les protéines d' enveloppe des rétrovirus peuvent également être substituées par les protéines d' enveloppe d' autres virus . Les VHCpp sont sécrétées dans le milieu de culture cellulaire et permettent une bonne transduction de cellules , de manière dépendante de la présence de E1 et E2 à leur surface ( Figure 9B ) . Elles présentent un tropisme préférentiel pour les cellules d' origine hépatique ( Bartosch et al. , 2003c ) . De plus , elles sont neutralisées spécifiquement par des anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine E2 et par des sérums de patients infectés ( Bartosch et al. , 2003a ; Bartosch et al. , 2003c ; Op De Beeck et al. , 2004 ) . Par contre , les pseudo-particules ne sont pas capables de se répliquer , permettant uniquement l' étude de l' étape d' entrée du VHC dans ses cellules cibles . 4.2.5 . Les réplicons Du fait de l' absence de systèmes cellulaires permissifs , l' étude de la réplication du VHC a été limitée jusqu'au développement des réplicons du VHC ( Lohmann et al. , 1999 ) . Les réplicons sont des ARN réplicatifs autonomes contenant typiquement une séquence codant un marqueur de sélection , comme par exemple la néomycine , sous le contrôle de l' IRES du VHC . Le gène de résistance à l' antibiotique est fusionné à la séquence N-terminale de la protéine de capside . Ensuite , l' IRES hétérologue du virus de l' encéphalomyocardite est responsable de la traduction du cadre de lecture du VHC , le tout étant encadré par les régions 5 ' NC et 3 ' NC du VHC ( pour revue ( Bartenschlager , 2006 ; Bartenschlager and Lohmann , 2001 ) . Des ARN bicistroniques compétents pour la réplication et codant la polyprotéine entière ont également été décrits ( Ikeda et al. , 2002 ; Pietschmann et al. , 2002 ) . Ces ARN génomiques , qui possèdent l' intégralité du génome viral , et les ARN sous-génomiques se répliquent de manière efficace dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 sous pression de sélection . Il a été montré que l' insertion de la séquence codant les protéines non structurales de NS3 à NS5B est nécessaire à la réplication ( Ikeda et al. , 2002 ; Lohmann et al. , 1999 ) . De plus , des mutations d' adaptation à la culture cellulaire augmentent significativement les niveaux de réplication des nouvelles cellules transfectées ( Blight et al. , 2000 ; Krieger et al. , 2001 ; Lohmann et al. , 2001 ; Lohmann et al. , 1999 ) . Un certain nombre de ces mutations ont été identifiées dans NS3 , NS4A , NS4B , NS5A et NS5B ( Blight et al. , 2000 ; Evans et al. , 2004 ; Ikeda et al. , 2002 ; Lemon , 2007 ; Neddermann et al. , 2004 ) . D' autre part , la réplication de ces ARN est fortement influencée par le status de prolifération des cellules hôtes , Huh- 7 , avec une diminution des ARN viraux lorsque les cellules atteignent une forte densité ( Pietschmann et al. , 2002 ; Scholle et al. , 2004 ) . Inversement , la synthèse de l' ARN est fortement stimulée pendant la phase S du cycle cellulaire ( Scholle et al. , 2004 ) . Les cellules avec des réplicons peuvent être « guéries » de la réplication de l' ARN du VHC par un traitement avec des concentrations modérées d' IFN- ? ( Blight et al. , 2002 ; Scholle et al. , 2004 ) . Cela a permis la sélection de cellules hautement permissives pour la réplication de l' ARN viral lorsqu' elles sont re-transfectées avec les ARN réplicons , les cellules Huh- 7.5 ( Lemon , 2007 ) . L' utilisation des réplicons a permis des avancées importantes dans l' étude de la réplication virale . Ces systèmes permettent l' étude de l' efficacité et des mécanismes d' action de molécules antivirales ciblant cette étape du cycle viral . Bien qu' aucun de ces réplicons n' ait permis la sécrétion de virions infectieux ( Blight et al. , 2003 ; Ikeda et al. , 2002 ; Pietschmann et al. , 2002 ; Sun et al. , 2004 ) , les études des clones moléculaires fonctionnels ont permis , par la suite , l' établissement du système de production virale en culture cellulaire . 4.2.6 . Les particules du VHC produites en culture cellulaire Le moyen le plus efficace et le plus pratique pour étudier un virus est de pouvoir le multiplier et le produire en culture cellulaire . En 2001 , un réplicon subgénomique de génotype 2a ( souche JFH- 1 ) a été cloné à partir d' un génome du VHC issu d' un patient japonais atteint d' une hépatite fulminante ( Kato et al. , 2003 ) . L' équipe japonaise a transcrit , à partir de l' ADNc du génome de ce clone JFH- 1 , l' ARN viral de longueur totale . La transfection de cellules hépatocytaires Huh- 7 avec cet ARN a conduit à la production de particules infectieuses ( Figure 9C ) ( Wakita et al. , 2005 ) . Ces particules virales ont été appelées VHCcc , pour VHC produit en culture cellulaire . Les VHCcc sont infectieuses sur des hépatocytes primaires humains , sur des cellules Huh- 7 naïves , chez le chimpanzé et chez des souris transplantées avec des hépatocytes humains ( Lindenbach et al. , 2005 ; Molina et al. , 2008 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhong et al. , 2005 ) . De plus , le sérum de chimpanzé infecté par les VHCcc permet la réinfection de cellules Huh- 7 naïves ( Wakita et al. , 2005 ) . La taille des particules intracellulaires est similaire à celle des particules sécrétées , mais la densité semble différente ( Gastaminza et al. , 2006 ) . L' analyse biochimique des particules sécretées révèle une densité variant entre 1 , 15 et 1 , 17g / mL. Elles sont sphériques et mesurent environ 55 nm de diamètre ( Wakita et al. , 2005 ) . Des systèmes de culture cellulaire permettant de produire des particules infectieuses d' autres génotypes ont été décrits depuis , mais l' efficacité de ces systèmes de production est plus faible ( Kato et al. , 2007 ; Yi et al. , 2006b ) . Plusieurs études ont alors porté sur la construction de virus chimériques . Des analyses sur un virus chimérique intragénotypique constitué du génome codant les protéines C-NS2 de la souche J6 ( génotype 2a ) fusionné au génome codant les protéines NS3-NS5B de la souche JFH- 1 ( génotype 2a ) ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Lindenbach et al. , 2005 ) ont permis de montrer que ces chimères se répliquent et sécrètent du virus infectieux ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Lindenbach et al. , 2005 ) . Ces virus chimériques sont également infectieux chez le chimpanzé et les souris humanisées , et les virus issus des animaux sont également capables d' infecter les cellules Huh- 7 ( Lindenbach et al. , 2006 ) . Cette dernière étude indique que le virus récupéré des animaux est plus infectieux , mais il se modifie rapidement après un passage en culture cellulaire . En outre , il y a une différence dans la répartition de la densité des particules virales selon leur provenance ; les virus plus infectieux présentent une densité plus faible ( Lindenbach et al. , 2006 ) . La confluence des cellules au moment de l' infection semble être également importante pour la cinétique et l' éfficacité de sécretion de nouveaux virions ( Koutsoudakis et al. , 2006 ) . Cependant , l' inconvénient des systèmes JFH- 1 et J6 / JFH-1 est que les particules sécrétées sont issues d' un génotype 2a pour lequel on ne dispose pas suffisament d' outils . Des chimères intergénotypiques ont alors été produites avec la partie N-terminale du génome codant la polyprotéine jusqu'à NS2 des génotypes 1b ( Con 1 ) , 1a ( H77 ) , 3a ( 452 ) , 4a ( ED43 ) fusionnés à la partie NS3-NS5B du génotype 2a du JFH- 1 ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Pietschmann et al. , 2006 ; Yi et al. , 2007 ) ( Scheel 2008 ) . Afin d' améliorer la sensibilité de détection des cellules infectées , des virus chimériques exprimant un gène rapporteur , la luciférase , ont également été produits . Certains auteurs ont construit un génome viral bicistronique composé d' une part du gène rapporteur et d' autre part du génome du VHC ( Koutsoudakis et al. , 2006 ) . D' autres , ont produit un génome viral monocistronique dans lequel le gène de la luciférase a été fusionné à la partie 5 ' du gène de la capside ( Tscherne et al. , 2006 ) . Les deux systèmes ont montré que l' apport de la luciférase permet d' améliorer la quantification des cellules infectées . D' autre part , plusieurs équipes ont cherché à augmenter le titre infectieux puisque l' équipe de Wakita et collaborateurs obtenait une production assez faible , de l' ordre de 103 unités formant des foyers par mililitre ( ffu / ml ) ( Wakita et al. , 2005 ) . Dans un premier temps , Cai et collaborateurs ont obtenu une bonne production de particules virales infectieuses en utilisant des cellules Huh- 7 transformées stablement par l' ADN du JFH- 1 ( Cai et al. , 2005b ) . Dans un deuxième temps , les études ont porté soit sur l' utilisation de cellules hautement permissives à la réplication virale , soit sur l' utilisation de chimères , ou encore en combinant les deux facteurs . Une population clonale de cellules issues de la lignée Huh- 7.5 ( nommée Huh- 7.5.1 ) produit en effet un bon titre viral , de l' ordre de 104 - 105 ffu / ml ( Zhong et al. , 2005 ) . D' autres auteurs ont utilisé la lignée Huh- 7.5 et des virus chimériques pour obtenir une production de VHCcc plus élevée ( Lindenbach et al. , 2005 ) , de l' ordre de 105 ffu / ml . Enfin , Delgrange et collaborateurs ont sélectionné un mutant naturel de la protéine E2 présentant une mutation qui change une asparagine en position 534 en lysine . Cette mutation abolit la glycosylation du sixième site de N-glycosylation de la glycoprotéine E2 ( N6 ) et facilite la production virale ( 103 - 104 ffu / ml ) ( Delgrange et al. , 2007 ) , suggèrant que l' absence de ce glycane favorise l' interaction de E2 avec un récepteur du VHC ou alors cette mutation améliore l' assemblage et la sécretion des particules infectieuses . Dans cette étude , ils ont montré également que des mutations dans la séquence de la capside ( la mutation de la phénylalanine 172 en cystéine et de la proline 173 en sérine ) produisent des virus très infectieux ( 104 & 226;& 128;& 147; 106 ffu / ml ) ( Delgrange et al. , 2007 ) . Enfin , la combinaison des mutations de la capside avec l' abolition du sixième site de N-glycosylation de E2 produit un virus VHCcc ( JFH- 1 / CS-N6 ) encore plus infectieux que les précedents , de l' ordre de 105 - 106 ffu / ml ( Delgrange et al. , 2007 ) . Il a fallu presque vingt ans depuis la découverte du VHC pour mettre au point un système de culture cellulaire permettant l' étude in vitro de toutes les étapes du cycle réplicatif . Jusqu'à présent , cette technique a permis de valider des résultats précédemment obtenus avec d' autres systèmes , comme le rôle de E1 et E2 pour l' entrée virale ( Wakita et al. , 2005 ) , le tropisme préferentiel pour les cellules hépatiques ( Lindenbach et al. , 2005 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhong et al. , 2005 ) et le rôle de récepteurs potentiels impliqués dans l' entrée du VHC ( Evans et al. , 2007 ; Grove et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Lindenbach et al. , 2005 ; von Hahn et al. , 2006 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhong et al. , 2005 ) . Cet outil permet également le screening de nouveaux agents antiviraux spécifiques du VHC ( Lindenbach et al. , 2005 ) ou de molécules inhibant l' entrée virale ( Helle et al. , 2006 ; Lavie et al. , 2006 ) . Ce système devrait permettre de progresser encore plus dans la connaissance du cycle de ce virus . 5 . Le cycle viral L' étude du cycle viral du VHC a longtemps été freiné par l' absence de système cellulaire capable de produire des virions infectieux . Cependant , un schéma général des différentes étapes ( Figure 10 ) a pu être établi par analogie avec des virus phylogénétiquement proches , mais également grâce à l' utilisation des différents modèles décrits précédemment . Figure 10 . Cycle viral putatif du VHC . Le virus se lie à la surface des cellules sur ses récepteurs spécifiques , il est ensuite endocyté par une voie dépendante de la clathrine . L' enveloppe virale fusionne alors avec la membrane des endosomes précoces , permettant l' introduction de l' ARN viral dans le cytoplasme . Le génome sert à la synthèse des protéines virales dans le RE et , en parallèle , il sert à la synthèse de brins négatifs qui serviront de matrice pour la synthèse de nouvelles molécules d' ARN de polarité positive . Les protéines structurales servent à l' assemblage de nouvelles particules virales . L' assemblage et l' encapsidation du génome viral sont associés à des gouttelettes lipidiques ( GL ) cellulaires . Les virions suivent enfin la voie de sécrétion jusqu'à leur export hors de la cellule . 5.1 . L' entrée du VHC dans ses cellules cibles L' interaction sélective des virus animaux avec leur ( s ) récepteur ( s ) spécifique ( s ) présent ( s ) à la surface des cellules cibles est une étape essentielle à l' initiation de l' infection . Cette interaction détermine souvent le spectre d' hôtes , le tropisme cellulaire et tissulaire du virus et joue un rôle essentiel dans la pathogénicité virale . Une particule virale peut utiliser de façon séquentielle plusieurs molécules durant le processus d' attachement et d' entrée virale . De plus , différents membres d' une même population virale peuvent utiliser des molécules distinctes pour entrer dans la cellule ( Schneider-Schaulies , 2000 ) . Le VHC semble utiliser plusieurs récepteurs pour entrer dans la cellule ( Figure 11 ) . En effet , il a été décrit que la tetraspanine CD81 , le récepteur scavenger SR-BI , la claudine 1 et le glycosaminoglycane de type héparane sulfate pouvaient jouer un rôle dans l' entrée du VHC dans ses cellules cibles . Un autre candidat récepteur est le récepteur aux LDL , du fait de l' association des particules virales du VHC avec les lipoprotéines dans le sérum de patients infectés . Figure 11 . Représentation schématique de l' entrée du VHC dans ses cellules cibles . Les GAGs et le LDL-R pourraient faciliter l' attachement initial des particules virales sur les cellules , par une interaction directe avec les glycoprotéines d' enveloppe E1E2 ou par l' intermédiaire des lipoprotéines , pour les diriger vers les protéines SR-BI et CD81 . CLDN1 agit à une étape tardive du processus d' entrée , après l' attachement et l' interaction avec CD81 . Le VHC entre alors dans les cellules par endocytose dépendante de la clathrine jusqu'aux endosomes précoces où la fusion des membranes se produit et le génome est libéré dans le cytoplasme . Une fois le virus fixé à la cellule , il fusionne son enveloppe avec les membranes cellulaires permettant ainsi la libération de la nucléocapside dans le cytoplasme cellulaire et la poursuite du cycle viral . Certains virus enveloppés fusionnent à la membrane plasmique et d' autres suivent une voie d' endocytose . Pour le VHC , il a été montré qu' il est internalisé par la voie d' endocytose dépendante de la clathrine , qui conduit les particules virales vers les compartiments endosomaux . Les facteurs jouant un rôle dans l' entrée du VHC dans ses cellules cibles seront plus développés par la suite ( Cf partie III . 2 . ) . 5.2 . La synthèse des protéines et la réplication virale La synthèse des protéines virales commence par la traduction de l' ORF , aboutissant à la formation des protéines virales ( Figures Figure 7B et Figure 10 ) . L' entrée du ribosome sur la séquence de l' ARN messager se fait en amont du codon initiateur de la traduction et est relayée par l' IRES , qui occupe la majeure partie de la région 5 ' NC ( Tsukiyama-Kohara et al. , 1992 ) . Après la traduction , le découpage des protéines virales codées par l' ORF est assuré par des protéases cellulaires et virales . D' abord , une signal peptidase située dans la lumière du RE clive les protéines structurales C / E 1 , E1 / E2 , E 2 / p 7 et p 7 / NS2 . Leurs extrémités C-terminales hydrophobes jouent un rôle important dans ce processus , car elles permettent la translocation des protéines dans le RE , leur insertion dans la membrane de ce compartiment et leur clivage . Les protéines non structurales , également ancrées dans la membrane du RE , sont clivées par deux protéases virales ( Grakoui et al. , 1993 ) : la protéase NS2 associée à la partie N-terminale de NS3 , qui clive la jonction NS2 / NS3 , et la sérine protéase NS3 associée à son cofacteur NS4A , qui assure le clivage de l' ensemble des jonctions situées en aval ( NS3 / NS4A , NS4A / NS4B , NS4B / NS5A et NS5A / NS5B ) ( Grakoui et al. , 1993 ) . Le complexe de réplication se forme pendant la maturation de la polyprotéine précurseur et il contient l' ARN polymérase dépendante de l' ARN ( NS5B ) , les autres protéines non structurales ( NS3 à 5A ) , des protéines cellulaires et l' ARN viral ( Ishido et al. , 1998 ) . La protéine NS2 ne semble pas être nécessaire à ce complexe , puisque des réplicons dépourvus de NS2 sont fonctionnels . Le complexe de réplication est associé aux structures membranaires et vésiculaires périnucléaires , qui semblent être le siège de la réplication virale . En effet , une altération spécifique des membranes , appelée réseau membranaire , a été identifiée comme étant le siège de réplication dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 contenant un réplicon subgénomique du VHC ( Gosert et al. , 2003 ) . Ce réseau membranaire peut être induit par NS4B seule et ressemble aux « inclusions de type éponge » observées dans des images de microscopie électronique de foie de chimpanzés infectés par le VHC ( Egger et al. , 2002 ) . Il est admis que le réseau membranaire dérive des membranes du RE . Une fois le complexe de réplication mis en place dans le réseau membranaire , l' ARN polymérase synthétise un brin d' ARN négatif à partir du génome , qui servira ensuite de matrice pour la synthèse de nombreux brins d' ARN positifs . Ces ARN seront encapsidés et enveloppés pour devenir les génomes des particules virales néoformées ou serviront de nouveaux messagers pour la synthèse de nouvelles protéines virales . 5.3 . L' assemblage et la sécrétion virale Les dernières étapes du cycle viral sont très mal connues . L' assemblage est probablement déclenché par l' interaction entre l' ARN génomique et la protéine de capside , qui aboutit à la formation de la nucléocapside par des mécanismes non encore élucidés ( Figure 10 ) ( Shimoike et al. , 1999 ) . En particulier , aucun signal d' encapsidation spécifique n' a été identifié . Par analogie avec les Flavivirus , les nucléocapsides du VHC pourraient s' envelopper par bourgeonnement à l' intérieur du RE , éventuellement sous l' influence d' interactions entre la protéine de capside et les glycoprotéines d' enveloppe . Les virions seraient ensuite secrétés par exocytose . Récemment , il a été montré que dans le système des VHCcc , la protéine de capside est associée aux GL ( Boulant et al. , 2007 ; Miyanari et al. , 2007 ; Rouille et al. , 2006 ; Shavinskaya et al. , 2007 ) , comme décrit avec d' autres systèmes ( Dubuisson et al. , 2002 ; Hope and McLauchlan , 2000 ; McLauchlan , 2000 ; McLauchlan et al. , 2002 ) . Ces études montrent que la protéine de capside recrute les protéines non-structurales , notamment NS5A , et les ARN viraux négatifs et positifs vers les GL ( Miyanari et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , tandis que la capside et les GL colocalisent , une fraction des protéines NS et les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 se localisent autour du complexe capside-GL ( Miyanari et al. , 2007 ; Rouille et al. , 2006 ) . La protéine de capside est également associée à un compartiment membranaire lui-même associé aux GL ( Rouille et al. , 2006 ) . De manière importante , il a été montré que l' association des protéines virales , de l' ARN viral et des GL , à proximité de ces compartiments membranaires associés aux GL , est essentiel pour la production de nouvelles particules virales ( Miyanari et al. , 2007 ) . De plus , il semblerait que l' attachement de la capside aux GL se fait après son clivage par la SPP , qui serait déterminant pour la production de particules infectieuses ( Targett-Adams et al. , 2008 ) . Bien que d' autres protéines non structurales semblent être impliquées dans la production de particules infectieuses , comme p 7 et NS2 ( Jones et al. , 2007 ; Steinmann et al. , 2007 ) , NS5A serait nécessaire pour leur association aux complexes capside-GL ( Miyanari et al. , 2007 ) . Dans ce sens , le domaine III de NS5A , et plus spécifiquement la phosphorylation de la sérine 457 par des kinases cellulaires , semble être important pour l' assemblage de virions infectieux ( Appel et al. , 2008 ; Tellinghuisen et al. , 2008 ) . De plus , la délétion du domaine III de NS5A empêche sa co-localisation avec la protéine de capside et les GL , ainsi que la production de particules infectieuses ( Appel et al. , 2008 ) . Il a également été montré que la production virale par les hépatocytes était dépendante de l' assemblage et de la sécrétion des VLDL ( Gastaminza et al. , 2008 ; Huang et al. , 2007 ) . Spécifiquement , le niveau de l' apolipoprotéine B semble être limitant pour l' assemblage des particules infectieuses et la sécrétion des particules dépend de la protéine de transfert microsomal ( MTP ) du RE , responsable de l' assemblage des VLDL ( Gastaminza et al. , 2008 ) . Dans ce sens , il a été montré que les particules virales sont assemblées dans un compartiment intracellulaire sous forme de particules de forte densité ( > 1 , 15g / mL ) , mais qu' elles acquièrent des éléments qui leur confèrent une faible densité ( < 1 , 14g / mL ) durant leur sécrétion ( Gastaminza et al. , 2006 ) . Des mutations empêchant l' association de la protéine de capside aux GL bloquent la production de particules infectieuses de basse densité , alors que les particules non-infectieuses de haute densité semblent suivre une voie différente ( Miyanari et al. , 2007 ) . Le travail de Gastaminza et collaborateurs indique qu' une partie des particules intracellulaires ou des composants essentiels à leur assemblage sont dégradés de manière dépendante de cystéine protéases cellulaires . Cependant , les particules virales de basse densité échappent à la dégradation et sont sécretées dans le milieu extracellulaire ( Gastaminza et al. , 2008 ) . De manière intéressante , les cystéine protéases participent également à la dégradation post-RE des apolipoprotéines B et E ( Adeli , 1994 ; Ye et al. , 1993 ) et , chez les patients infectés , les particules du VHC sont associées à ces apolipoprotéines ( Andre et al. , 2002 ; Nielsen et al. , 2006 ) . Gastaminza et collaborateurs proposent que les particules précurseurs du VHC sont ciblées vers la dégradation , si leur maturation post-RE ( par exemple l' addition de lipides ) n' a pas lieu ( Gastaminza et al. , 2008 ) . L' assemblage de ces particules précurseurs se fait dans le RE de manière dépendante de la MTP et leur maturation post-RE est nécessaire à la sécrétion . Ces études indiquent que l' interaction de la protéine de capside ou des nucléocapsides néoformées avec le métabolisme des lipides pourrait jouer un rôle dans la maturation des virions et expliquer la présence , dans le sang circulant , de particules virales associées aux lipoprotéines , qui constituent d' ailleurs la majeure partie de la fraction infectieuse . III . L' entrée du VHC dans ses cellules cibles 1 . Les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 Les glycoprotéines d' enveloppe du VHC jouent des rôles majeurs à différentes étapes du cycle viral . En effet , elles participent à la formation des particules virales infectieuses ( Wakita et al. , 2005 ) et sont essentielles à l' entrée des virus dans les cellules cibles ( pour revue ( Cocquerel et al. , 2006 ) . Les deux glycoprotéines E1 ( acides aminés 192 à 383 ) et E2 ( acides aminés 384 à 746 ) sont produites après clivage de la polyprotéine précurseur par des peptidases signal ( Dubuisson et al. , 2002 ) ( Figures 7B , 8 et 12 ) . Le clivage au niveau des sites C / E 1 , E1 / E2 et E 2 / p 7 / NS2 produit E1 et un précurseur E 2 -p 7 -NS2 . Celui -ci est très rapidement clivé pour libérer E2 , une forme E 2 -p 7 et NS2 ( Dubuisson et al. , 1994 ) . E1 et E2 sont des protéines membranaires de type I avec un large ectodomaine N-terminal hautement N-glycosylé et un TMD C-terminal constitué d' un seul passage ( Figure 12A ) . Lors de la traduction de l' ORF , le domaine 3 de la protéine de capside est responsable du signal de clivage entre C et E1 , ainsi que de la translocation de l' ectodomaine de E1 dans la lumière du RE ( Santolini et al. , 1994 ) . L' ectodomaine de la protéine E2 est également dirigé vers la lumière du RE par un signal présent dans le TMD de E1 ( Cocquerel et al. , 1999 ; Cocquerel et al. , 2000 ) . Les TMD des deux glycoprotéines sont ensuite ancrés dans la membrane du RE ( Figure 8 ) et les glycoprotéines forment des hétérodimères E1E2 qui sont retenus au niveau de ce compartiment . Les TMD de E1 et E2 ont été largement caractérisés dans le laboratoire et il a été montré que ceux -ci sont multifonctionnels ( Figure 12A ) . En effet , en plus de leur fonction d' ancrage membranaire et d' adressage , ces domaines sont responsables de la rétention stricte des hétérodimères E1E2 dans le RE ( Cocquerel et al. , 1999 ; Cocquerel et al. , 1998 ; Cocquerel et al. , 2000 ) . Ils sont également impliqués dans l' hétérodimérisation des deux glycoprotéines et jouent un rôle dans l' entrée virale ( Ciczora et al. , 2005 ) . De plus , il a été montré que la mutation de certains résidus des TMD de E1 et de E2 altère la propriété de fusion de ces glycoprotéines d' enveloppe suggérant qu' ils jouent également un rôle majeur dans le mécanisme de fusion ( Ciczora et al. , 2007 ) . Enfin , il a été montré que des résidus chargés présents dans les TMD de E1 et de E2 sont importants pour la multifonctionnalité de ces domaines ( Cocquerel et al. , 2000 ) et cette multifonctionnalité est liée à une dynamique topologique ( Cocquerel et al. , 2002 ) . Figure 12 . Représentation schématique de l' organisation structurale et fonctionnelle des glycoprotéines d' enveloppe du VHC . Des schémas consensuels de l' organisation des domaines structuraux de E1 et E2 sont représentés . Les N-glycanes , en rouge , sont positionnés au dessus ; les peptides de fusion prédits sont en jaune ; les régions HVR , en vert ; et les TMD , en rose . Les résidus de E2 impliqués dans l' interaction avec la molécule CD81 sont indiqués par des flèches bleues : W437 , L438 , L441 , P442 ( Drummer et al. , J. Virol . 2006 ) , W420 , Y527 , W529 , G 530 , D535 ( Owsianka et al. , J. Virol . 2006 ) . Au cours de leur passage dans le RE , les glycoprotéines E1 et E2 peuvent former deux types de complexes : les hétérodimères non covalents et les agrégats hétérogènes liés par des ponts disulfures ( Deleersnyder et al. , 1997 ; Dubuisson et al. , 1994 ) . Il est admis que la forme fonctionnelle soit la première . D' autre part , le repliement de la protéine E1 est dépendant de la co-expression de E2 , alors que la protéine E2 peut atteindre un état conformationnel avancé en absence de E1 ( Michalak et al. , 1997 ) . D' ailleurs , l' interaction entre les TMD des deux protéines est indispensable au repliement de E1 ( Dubuisson et al. , 2000 ) , mais ne semble influencer que les étapes finales du repliement de E2 ( Cocquerel et al. , 2002 ) . La mise en conformation de ces deux glycoprotéines est contrôlée par les protéines chaperones du RE , telles que la calnexine , qui s' associe plutôt aux hétérodimères non-covalents , et les protéines calréticuline et BiP , qui interagissent préférentiellement avec les agrégats covalents ( Choukhi et al. , 1998 ) . Par ailleurs , E2 contient une région hypervariable d' environ 27 acides aminés ( 384 à 410 ) , appelée HVR1 . La forte variabilité de cette région pourrait permettre aux virus d' échapper au système immunitaire . En effet , des virus délétés de cette région présentent une infection atténuée chez le chimpanzé ( Forns et al. , 2000 ) . Malgré la variabilité de cette séquence , ses propriétés physico-chimiques et sa conformation spatiale sont relativement conservées à travers les différents génotypes ( Penin et al. , 2001 ) . Elle est composée de plusieurs acides aminés basiques qui modulent l' infectiosité du VHC ( Callens et al. , 2005 ) . D' autres régions hypervariables pouvant jouer un rôle dans l' entrée virale ont été décrites : HVR2 ( résidus 474 à 482 ) ( Roccasecca et al. , 2003 ; Weiner et al. , 1991 ) et HVR3 ( résidus 431 à 466 ) ( Troesch et al. , 2006 ) . La région HVR2 est d' ailleurs très conservée parmi les isolats du VHC ( McCaffrey et al. , 2007 ) . La glycoprotéine E2 serait plutôt responsable de l' attachement de la particule virale aux cellules cibles en interagissant avec les différentes molécules qui jouent un rôle dans l' entrée virale . Le rôle de E1 dans l' infection est moins bien établi . Cependant , plusieurs anticorps dirigés contre E1 sont capables de neutraliser l' entrée ( Dreux et al. , 2006 ; Keck et al. , 2004 ; Pietschmann et al. , 2006 ) , ainsi que des anticorps conformationnels reconnaissant les hétérodimères E1E2 ( Drummer et al. , 2006 ; Flint et al. , 1999a ; Hadlock et al. , 2000 ) . Il a été montré que les niveaux d' incorporation de E1 seule sur les VHCpp sont réduits et que ces particules ne sont pas infectieuses . Les deux glycoprotéines doivent alors être incorporées sur les particules pour permettre une production virale efficace ( Bartosch et al. , 2003d ; Hsu et al. , 2003 ) . L' utilisation des formes sE 2 a permis l' identification de récepteurs putatifs pour le VHC , dont CD81 ( Pileri et al. , 1998 ) . Cependant , des formes tronquées intracellulaires de E2 s' associent à CD81 avec une plus grande affinité que les formes sécrétées ( Flint et al. , 2000 ; Heile et al. , 2000 ) , suggérant que des différences structurales existent entre les formes sécrétées et les formes intracellulaires de E2 . En effet , certains anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels de E2 ne reconnaissent pas la forme s E2 - 661 ni E2 exprimée en absence de E1 . Ceci suggère que des différences de conformation existent entre les hétérodimères E1E2 et les glycoprotéines exprimées seules ( Cocquerel et al. , 2003b ) . L' interaction de CD81 avec des hétérodimères E1E2 se fait d' ailleurs avec une plus forte affinité que l' interaction CD81 / sE 2 ( Cocquerel et al. , 2003a ) . Par ailleurs , la forme sE 2 de génotype 1a possède une plus forte affinité pour CD81 que les sE 2 d' autres génotypes . Cependant , les VHCpp- 1b infectent les cellules de manière dépendante de CD81 , suggérant que l' interaction entre CD81 et sE 2 ne prédit pas l' interaction de CD81 avec les VHCpp ( Zhang et al. , 2004a ) . En effet , des différences ont été observées en comparant les interactions sE 2 -CD81 et l' infectiosité de VHCpp et VHCcc ( Bertaux and Dragic , 2006 ; Flint et al. , 2006 ; Zhang et al. , 2004a ) . L' expression de la CD81 de différentes espèces dans les cellules HepG 2 permet de les rendre permissives à l' infection des VHCcc et VHCpp , alors que la forme sE 2 ne s' associe qu' aux HepG 2 exprimant la CD81 humaine , de chimpanzé et de tamarin ( Flint et al. , 2006 ) . De plus , une mutation dans la séquence de CD81 qui dissociait son interaction avec sE 2 permet également de rendre les HepG 2 permissives aux VHCpp ( Zhang et al. , 2004a ) . Les ectodomaines des protéines E1 et E2 sont hautement glycosylés ( Figure 12B ) . La protéine E1 contient quatre site de glycosylation très conservés ( positions 196 , 209 , 234 et 305 ) . D' autres sites potentiels ne sont conservés que dans certains génotypes : un site en position 250 dans les séquences de génotypes 1b et 6 et un autre site en position 299 dans le génotype 2b ( Figure 12B ) ( Goffard and Dubuisson , 2003 ; Zhang et al. , 2004b ) . La protéine E2 possède neuf sites potentiels de glycosylation très conservés dans tous les génotypes ( positions 417 , 423 , 430 , 448 , 532 , 576 , 623 et 645 ) ( Figure 12B ) . Un site en position 476 semble rarement présent dans les séquences de génotype 1b et un autre site , en position 540 est absent des génotypes 3 et de la majorité des génotypes 6 . Malgré la forte variabilité du VHC , la conservation importante des sites de glycosylation suggère un rôle essentiel des glycanes dans le cycle viral . Dans le RE , les sites de glycosylation de E1 et E2 sont modifiés par N-glycosylation ( Goffard et al. , 2005 ; Goffard and Dubuisson , 2003 ) et la présence de E2 est indispensable pour que la protéine E1 soit correctement glycosylée ( Dubuisson et al. , 2000 ) . Toutefois , ce phénomène ne semble pas dépendre d' une séquence spécifique de E2 . Par ailleurs , les glycoprotéines associées aux VHCpp contiennent des glycanes complexes , suggérant que certains sont probablement modifiés par des enzymes du Golgi ( Op De Beeck et al. , 2004 ) et sont très probablement modifiés après l' assemblage et le relargage des particules virales ( Flint et al. , 2004 ; Lozach et al. , 2004 ; Op De Beeck et al. , 2004 ) . L' étude du rôle fonctionnel des glycanes associés aux protéines d' enveloppe du VHC a montré qu' ils jouaient un rôle majeur dans le repliement de ces protéines , ainsi que dans l' entrée virale ( Goffard et al. , 2005 ) . En effet , certains glycanes sont importants pour le repliement et l' hétérodimèrisation de E1 et E2 , tandis que d' autres modulent l' infectiosité des VHCpp . Par exemple , les glycanes de E2 en position 417 , 532 et 645 réduisent la sensibilité des VHCpp à des anticorps neutralisants et diminuent également l' accessibilité de CD81 à son site d' association sur E2 ( Falkowska et al. , 2007 ; Helle et al. , 2007 ) . Ceci indique que ces glycanes sont proches de la région de E2 interagissant avec CD81 et que cette région est une cible majeure des anticorps neutralisants . De plus , la glycosylation de ces trois sites , qui protégent le site d' association à CD81 de la neutralisation , est hautement conservée ( Helle et al. , 2007 ) . De manière intéressante , une mutation adaptative abolissant le sixième site de N-glycosylation de E2 ( en position 532 ) augmente l' infectiosité des VHCcc ( Delgrange et al. , 2007 ) . Les glycoprotéines d' enveloppe E1 et E2 sont des cibles intéressantes pour le développement de nouveaux anti-viraux . En effet , une lectine issue de cyano-bactéries , la Cyanovirin-N , possède une haute spécificité pour les glycanes présents à la surface virale et inhibe l' entrée du VHC ( Helle et al. , 2006 ) . De plus , il a été montré pour d' autres virus glycosylés , comme le VIH , que des drogues dirigées contre les glycanes présents sur les protéines d' enveloppe , comme la chloroquine et ses analogues , en combinaison avec le traitement classique , diminue la charge virale ( Boelaert et al. , 1999 ; Paton and Aboulhab , 2005 ; Romanelli et al. , 2004 ; Sperber et al. , 1995 ) . Cette approche pourrait être appliquée à d' autres virus glycosylés , car la chloroquine s' accumule dans l' endosome empêchant son acidification , une étape importante pour la fusion et l' entrée dans le cytoplasme cellulaire pour de nombreux virus , comme le VHC . La chloroquine peut également affecter l' activité des glycosyltransférases dans le RE et l' appareil de Golgi , empéchant l' addition de glycanes sur les protéines et l' association avec les protéines chaperon du RE , calnexine et calréticuline . Sans l' assistance de ces protéines chaperones , les protéines virales , comme E1 et E2 , ne sont pas correctement repliées et ne sont pas fonctionnelles ( Vigerust and Shepherd , 2007 ) . Des inhibiteurs de glucosidases pourraient également être utilisés contre le VHC . En ce qui concerne le VHC , en utilisant les sytèmes VLP , VHCpp et VHCcc , il a été montré que les inhibiteurs de glucosidase entraînent un mauvais repliement des protéines d' enveloppe et une mauvaise interaction des particules avec les cellules , ce qui diminue l' infectiosité des particules virales ( Chapel et al. , 2007 ; Chapel et al. , 2006 ) . Bien que ces inhibiteurs ciblent des enzymes cellulaires , la maturation des protéines cellulaires ne semble pas affectée . Le mauvais repliement des protéines virales aurait une conséquence dramatique sur l' assemblage des particules virales , alors que les protéines cellulaires passeraient le contrôle qualité du RE et resteraient biologiquement actives même après quelques changements au niveau de leur glycosylation ( Rudd and Dwek , 1997 ) . 2 . Les protéines cellulaires impliquées dans l' entrée du VHC 2.1 . Les molécules d' attachement Des formes recombinantes de la protéine E2 , des VHCpp et des particules virales présentes dans le sérum de patients infectés interagissent spécifiquement avec les lectines DC-SIGN et L-SIGN ( Cormier et al. , 2004a ; Gardner et al. , 2003 ; Lozach et al. , 2004 ; Lozach et al. , 2003 ; Pohlmann et al. , 2003 ) . Ces molécules sont des lectines de type C capables de reconnaître des structures glycanes de manière dépendante du calcium . L-SIGN est exprimée , entre autres , à la surface des cellules de l' endothélium bordant les capillaires sinusoïdes du foie ( Pohlmann et al. , 2001 ) . De son côté , DC-SIGN est rétrouvée à la surface des cellules dendritiques et de quelques populations de macrophages , comme les cellules de Kupffer , qui se localisent dans le parenchyme hépatique ( Soilleux et al. , 2002 ) . Ces deux lectines sont capables de reconnaître des structures glycaniques à la surface de certains pathogènes ( Koppel et al. , 2005 ) . Il a été montré que la liaison de E2 à L-SIGN pouvait induire la transmission de VHCpp à des cellules hépatiques adjacentes ( Cormier et al. , 2004a ; Gardner et al. , 2003 ) . Etant donné que L-SIGN et DC-SIGN ne sont pas exprimées à la surface des hépatocytes , elles ne peuvent pas être des récepteurs spécifiques de ces cellules . Dans ce sens , il a été montré qu' elles ne permettent pas l' entrée des VHCpp et VHCcc ( Lai et al. , 2006 ) . Il est envisageable qu' elles contribueraient à l' établissement de l' infection persistante en capturant et concentrant le virus dans les hépatocytes . Cependant , ce processus doit encore être démontré in vivo . Une autre lectine de type C , le récepteur aux asialoglycoprotéines , a été proposée comme récepteur pour le VHC ( Saunier et al. , 2003 ) . Elle est localisée principalement à la surface des hépatocytes ( Stockert , 1995 ) ) et peut interagir avec les VLPs produites dans des cellules d' insectes ( Saunier et al. , 2003 ) . Néanmoins , ces données n' ont jamais été confirmées dans d' autres systèmes . Une autre molécule qui semble participer à l' attachement du VHC est le glycosaminoglycane héparane sulfate présent à la surface des hépatocytes ( Figure 11 ) . Les glycosaminoglycanes ( GAG ) sont caractérisés par une grande hétérogénéité structurale leur permettant d' interagir spécifiquement avec de nombreuses protéines et ils servent de premier point d' attache cellulaire pour certains virus avant l' interaction avec leur ( s ) récepteur ( s ) ( Villanueva et al. , 2005 ) . D' autres virus , comme le virus de la dengue et celui de la fièvre jaune , s' en servent comme récepteur d' entrée ( Chen et al. , 1997 ; Germi et al. , 2002b ) . Par rapport au VHC , il a été montré que la protéine E2 interagit spécifiquement avec l' héparane sulfate présent à la surface des lignées humaines d' origine hépatique ( Barth et al. , 2003 ) . Par contre , aucune interaction directe avec E2 isolée des VHCpp n' a été démontrée ( Callens et al. , 2005 ) . L' héparine ( homologue structurale des héparane sulfates ) , des héparinases et le dextrane sulfate sont capables de diminuer l' attachement de particules virales présentes dans le sérum de patients infectés , de pseudoparticules arborant E1 et E2 chimériques et des VHCcc aux cellules cibles , ainsi que d' inhiber l' infection des VHCcc dans ces cellules ( Cribier et al. , 1998 ; Germi et al. , 2002a ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Meyer et al. , 2000 ) . Des expériences de cinétique à 4 °C et à 37 °C suggérent que les GAG ne sont pas des récepteurs proprements dits du VHC , mais facilitent plutôt l' attachement des VHCcc à la surface des cellules ( Koutsoudakis et al. , 2006 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Il est possible que le VHC interagisse avec les GAG de façon indirecte , via les lipoprotéines associées aux particules virales . Dans ce sens , la lipoprotéine lipase ( LPL ) permet une interaction indirecte entre le VHC et les GAG ( Andreo et al. , 2007 ) . Néanmoins , l' attachement des particules virales via la LPL semble diriger les particules vers une voie non-productive , puisqu' elle inhibe l' infection par les VHCcc . La participation du récepteur des lipoprotéines de faible densité ( LDL-R ) dans l' entrée virale a également été proposée ( Figure 11 ) . En effet , plusieurs observations suggèrent cette participation . D' abord , il a été observé que chez les patients VHC positifs présentant une cryoglobulinémie mixte , les lésions cutanées causées par les complexes de cryoglobulines sont associées à une augmentation du niveau d' expression de LDL-R ( Agnello and Abel , 1997 ) . De plus , dans le sérum des patients infectés , les particules infectieuses sont associées à des LDL et des VLDL ( Andre et al. , 2002 ) , suggèrant que le VHC pourrait se servir de sa couverture de lipoprotéines pour utiliser le LDL-R comme récepteur d' entrée dans les cellules cibles . Dans ce sens , des anti-LDL-R , des anti-apolipoprotéines B et E , ainsi que des VLDL et des LDL purifiées inhibent l' entrée du VHC ( Agnello et al. , 1999 ; Bartosch et al. , 2003c ; Chang et al. , 2007 ; Germi et al. , 2002a ; Monazahian et al. , 1999 ; Wunschmann et al. , 2000 ) . Les VLDL pourraient participer à la morphogenèse du virus dans ces cellules , comme expliqué précédemment . De plus , il existe une correlation entre l' accumulation de l' ARN du VHC dans les hépatocytes primaires , l' expression de l' ARN messager du LDL-R et l' entrée des LDL ( Molina et al. , 2007 ) . Il a été suggéré que E2 interagirait avec les LDL pour former un complexe qui augmenterait l' affinité du virus pour les LDL-R et faciliterait l' introduction du virus dans la cellule ( Nahmias et al. , 2006 ; Wunschmann et al. , 2006 ) . Néanmoins , le LDL-R est exprimé également à la surface de cellules non permissives au VHC ( Bartosch et al. , 2003c ) , suggérant qu' il n' est pas la seule voie d' entrée des particules . 2.2 . Les récepteurs 2.2.1 . La tétraspanine CD81 La structure de CD81 CD81 est une protéine appartenant à la famille des tétraspanines . Ces protéines sont composées de quatre TMD , deux boucles extracellulaires , une petite ( SEL ) et une grande ( LEL ) , et des extrémités N- et C-terminales intracellulaires ( Figures 11 et 13 ) ( Levy and Shoham , 2005c ) . La structure de la LEL de CD81 a été analysée par diffraction aux rayons X après cristallisation . Kitadokoro et collaborateurs ont ainsi obtenu un dimère de domaines LEL , chacun constitué de cinq hélices ? organisées en deux domaines : les hélices A et E interagissent entre elles pour former un « pied » coiffé des trois autres hélices ( B , C et D ) . Cette « coiffe » est stabilisée par deux ponts disulfures ( Kitadokoro et al. , 2001 ) . Le « pied » contient une face hydrophobe qui participerait à la dimérisation du domaine LEL en solution , mais pourrait être impliquée dans d' autres types d' interactions dans la molécule entière , notamment avec la SEL ( Seigneuret , 2006 ) ( Figure 13B ) . Par ailleurs , les hélices C et D présentent une grande variabilité de séquence entre les différentes tétraspanines humaines , avec seulement 6 , 7 % de résidus conservés ( Stipp et al. , 2003b ) . Ce domaine plus variable pourrait donner la spécificité à chaque tétraspanine ( Bienstock and Barrett , 2001 ; Seigneuret et al. , 2001 ) . Figure 13 . Organisation de la tétraspanine CD81 . A ) Représentation schematique de CD81 ( d' après Levy G = glycine ; N = asparagine ; E = acide glutamique . B ) Structure des hélices a de la LEL . A et E forment un « pied » coiffé par B , C et D. Le domaine variable constitué des hélices C et D est représenté en rouge ( d' après Seigneuret et al. , JBC 2001 ) . CD81 joue un rôle dans l' entrée du VHC En 1998 , Pileri et collaborateurs ont identifié la tétraspanine CD81 en tant que récepteur du VHC ( Figures 11 et 13 ) . Cette découverte a été réalisée en utilisant une banque d' ADNc dérivée d' une lignée de lymphocytes T ( Molt- 4 ) qui présentait une haute capacité d' interaction avec sE 2 du VHC . Ils ont montré que cette interaction pouvait être spécifiquement inhibée par des anticorps dirigés contre CD81 . De plus , une forme soluble de la LEL de CD81 humaine pouvait se lier à sE 2 . L' interaction entre sE 2 et la CD81 humaine était inhibée par du sérum de chimpanzés vaccinés avec sE 2 , démontrant la relevance physiologique de cette interaction ( Pileri et al. , 1998 ) . L' interaction de E2 avec CD81 est spécifique de cette tétraspanine car d' autres tétraspanines telles que CD9 , CD63 et CD151 ne se lient pas à E2 ( Flint et al. , 1999a ; Zhang et al. , 2004a ) . Le rôle de CD81 dans l' infection du VHC a été confirmé avec les VHCpp et VHCcc . En effet , l' entrée de ces particules virales est inhibée par des anticorps dirigés contre CD81 , ainsi que par une forme soluble de la LEL de CD81 ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005b ; Lindenbach et al. , 2005 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhang et al. , 2004a ; Zhong et al. , 2005 ) . En outre , l' utilisation d' ARN intérferents réduisant l' expression de CD81 dans les cellules hépatocytaires Huh- 7 diminue remarquablement l' infection par les VHCpp , VHCcc et particules dérivées de sérums de patients infectés ( Evans et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2007 ; Molina et al. , 2008 ; Zeisel et al. , 2007 ; Zhang et al. , 2004a ) . Les VHCpp et VHCcc ont d' ailleurs un tropisme préferentiel pour les lignées hépatiques humaines exprimant CD81 ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ; Evans et al. , 2007 ; Flint et al. , 2006 ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005b ; Lindenbach et al. , 2005 ; Lindenbach et al. , 2006 ; Wakita et al. , 2005 ; Zhang et al. , 2004a ; Zhong et al. , 2005 ) et CD81 est nécessaire à l' entrée des VHCpp de tous les génotypes ( Lavillette et al. , 2005b ; McKeating et al. , 2004 ) . Cependant , il semblerait que l' affinité de E2 pour CD81 diffère selon le génotype viral ( Roccasecca et al. , 2003 ; Shaw et al. , 2003 ; Yagnik et al. , 2000 ) . Enfin , l' expression ectopique de CD81 humaine dans les cellules hépatocytaires humaines HepG 2 , qui n' expriment pas de CD81 , permet de les rendre permissives aux VHCpp ou VHCcc ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ; Flint et al. , 2006 ; Lavillette et al. , 2005b ; Lindenbach et al. , 2005 ; McKeating et al. , 2004 ; Zhang et al. , 2004a ) . Les résidus de CD81 importants pour son interaction avec E2 Différentes études ont contribué à identifier la région et les résidus de CD81 impliqués dans l' interaction avec E2 . Il a été montré que la LEL de CD81 est la région responsable de son interaction avec E2 ( Pileri et al. , 1998 ; Zhang et al. , 2004a ) et que les ponts disulfures de la LEL sont nécessaires à la reconnaissance de CD81 par sE 2 ( Drummer et al. , 2002 ; Petracca et al. , 2000 ) . La comparaison entre la CD81 humaine , celle du singe vert d' Afrique et celle du tamarin a permis d' identifier le résidu F186 comme crucial pour l' interaction avec E2 ( Flint et al. , 1999a ; Higginbottom et al. , 2000 ; Kitadokoro et al. , 2001 ; Meola et al. , 2000 ; Pileri et al. , 1998 ) . En effet , la LEL de CD81 du singe vert d' Afrique , qui possède un résidu différent à cette position , ne se lie pas à sE 2 , alors que la LEL de CD81 du tamarin s' associe à E2 et possède le même résidu que chez l' homme . D' autres résidus présents dans le domaine formé par les hélices C et D , tels que L162 , I181 , I182 , N184 et L185 , ont également été identifiés ( Drummer et al. , 2002 ; Kitadokoro et al. , 2001 ) . Des molécules mimant l' hélice D de CD81 sont d' ailleurs capables d' inhiber compétitivement l' association entre E2 et CD81 ( VanCompernolle et al. , 2003 ) . Néanmoins , ces études ont été réalisées en utilisant des formes solubles de CD81 et de E2 . Des différences d' association avec E2 ont pu être observées entre la LEL soluble et la molécule CD81 entière ( Drummer et al. , 2005 ; Flint et al. , 2006 ) . Des différences structurales existent également entre les formes tronquées et les formes natives de E2 , comme expliqué précédemment . Des mutations dans la séquence de la LEL humaine ( 182 , 184 et 186 ) avaient été associées à une diminution de l' interaction entre CD81 et sE 2 . Toutefois elles inhibent peu ou pas l' infection des VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ; Flint et al. , 2006 ) . L' étude de Bertaux et collaborateurs suggère que d' autres régions de la molécule de CD81 , comme la région C-terminale , la palmitoylation des cystéines juxtamembranaires et les résidus transmembranaires C80 et N18 / E219 seraient importants pour l' interaction avec les VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ) . La SEL de CD81 pourrait également être importante pour l' infection , car elle est nécessaire à l' expression optimale de CD81 à la surface cellulaire ( Masciopinto et al. , 2001 ) . Cependant , Flint et collaborateurs ont montré que des protéines chimériques de rat exprimant la LEL humaine sont capables de rendre les HepG 2 permissives à l' infection des VHCpp et VHCcc , tandis que des protéines chimériques humaines exprimant la LEL de rat ne rendent pas ces cellules infectables ( Flint et al. , 2006 ) . Ceci indique que la LEL est la région de CD81 qui définit l' infection par le VHC . Les résidus de E2 importants pour son interaction avec CD81 Des régions et résidus de E2 importants pour son interaction avec CD81 ont également était identifiés ( Figure 12B ) . Le site de E2 responsable de son interaction avec CD81 serait conformationnel ( Drummer et al. , 2006 ; Flint et al. , 1999a ; Hadlock et al. , 2000 ) . Des études réalisées avec sE 2 , des hétérodimères E1E2 ou des VLP ont identifié plusieurs régions de E2 importantes pour son interaction avec CD81 , entre les résidus : 412 - 447 ( Hsu et al. , 2003 ; McCaffrey et al. , 2007 ; Owsianka et al. , 2001 ) ; 480 - 493 ( Flint et al. , 1999a ; Owsianka et al. , 2001 ; Patel et al. , 2000 ) ; 528 - 535 ( Owsianka et al. , 2001 ; Yagnik et al. , 2000 ) ; 544 - 551 ( Flint et al. , 1999a ; Owsianka et al. , 2001 ) ; et 613 - 618 ( Roccasecca et al. , 2003 ; Yagnik et al. , 2000 ) . Les régions HVR1 et HVR2 pourraient moduler l' accessibilité au site de CD81 ( Roccasecca et al. , 2003 ) et la région localisée entre HVR1 et HVR2 , G436WLAGLFY , serait impliquée dans l' interaction des VHCpp avec CD81 ( Drummer et al. , 2006 ) . Ce motif , présentant des caractéristiques de peptide de fusion de type II , participerait à des étapes pré- et post-interaction avec CD81 et les résidus 437 , 438 , 441 et 442 contribueraient directement au site d' association avec CD81 ( Drummer et al. , 2006 ) . La mutagenèse de E2 dans le contexte des VHCpp a également permis d' identifier les résidus participant à l' interaction de E2 avec CD81 ( 420 , 527 , 529 , 530 et 535 ) ( Owsianka et al. , 2006 ) . Par contre , à l' opposé des résultats obtenus avec la sE 2 , les hétérodimères E1E2 et les VLP , cette étude a montré que la région entre les résidus 474 et 495 ne participe pas directement de l' association entre E2 et CD81 ( Owsianka et al. , 2006 ) . L' importance des résidus Trp 437 -Leu 438 -Leu 441 -Phe 442 et Tyr 527 -Trp 529 -Gly 530 -Asp 535 de E2 et Ile 181 -Ile 182 -Leu 185 -Phe 186 de CD81 pour l' association E2-CD81 indique que l' interaction se fait probablement entre des résidus hydrophobes présents dans les deux molécules ( Drummer et al. , 2006 ; Owsianka et al. , 2006 ) . CD81 et la spécificité d' espèce L' interaction entre E2 et CD81 ne requiert pas d' autres molécules étant donné que l' expression exogène de CD81 humaine dans des lignées de rat est suffisante pour l' attachement de E2 ( Flint et al. , 1999a ) . CD81 de certaines espèces , comme les tamarins et les chimpanzés , est capable d' interagir avec sE 2 ( Allander et al. , 2000 ; Flint et al. , 2006 ; Meola et al. , 2000 ) . Par contre , sE 2 n' interagit pas avec CD81 issue de souris ou de rat ( Allander et al. , 2000 ; Flint et al. , 2006 ) et l' expression de CD81 humaine dans des souris transgéniques ne permet pas l' infection par le VHC ( Masciopinto et al. , 2002 ) . Il a été montré que les VHCpp n' infectent pas non plus les lignées non hépatocytaires non humaines , telles que les cellules CHO d' hamster et les cellules Cos- 7 de singe vert d' Afrique ( Bartosch et al. , 2003c ; Bartosch et al. , 2003d ; Lavillette et al. , 2005b ) , même lorsque les CHO expriment la CD81 humaine ( Bartosch et al. , 2003d ; Evans et al. , 2007 ; Lavillette et al. , 2005b ) . De même , les cellules hépatocytaires murines ne sont pas infectables par les VHCpp , telles que les Hepa 1 - 6 ( Zhang et al. , 2004a ) et les NIH-3T3 exprimant la CD81 humaine ( Bartosch et al. , 2003c ; Cormier et al. , 2004b ) . Les résultats de l' infection des VHCpp sur les cellules hépatocytaires humaines HepG 2 exprimant de manière ectopique la CD81 murine ne sont pas aussi clairs . Tandis que Bertaux & Dragic montrent que ces cellules ne sont pas permissives aux VHCpp ( Bertaux and Dragic , 2006 ) , les résultats de Flint et collaborateurs indiquent que les HepG 2 exprimant la CD81 murine sont non seulement permissives aux VHCpp , mais également aux VHCcc ( Flint et al. , 2006 ) . Cette dernière étude montre également que l' expression ectopique de CD81 de chimpanzé , de tamarin et de singe vert d' Afrique permet de rendre les HepG 2 permissives aux VHCpp et VHCcc . Les CD81 de rongeurs , souris , rat et hamster permettent l' infection des VHCpp et VHCcc , mais avec des niveaux réduits par rapport à CD81 de primates , suggérant une affinité plus faible entre E2 et CD81 de rongeurs ( Flint et al. , 2006 ) . Ensemble , ces résultats indiquent que CD81 n' est pas le déterminant de la spécificité d' espèces . CD81 et la cinétique de l' entrée virale CD81 semble jouer un rôle après l' attachement des particules virales aux cellules . L' étude de la cinétique de l' infection est possible par l' incubation des virus avec les cellules à 4 °C pendant 1h. Sous ces conditions , l' attachement des virus aux cellules a lieu , mais ils n' entrent pas de manière efficace . L' entrée des particules virales dans les cellules se fait à partir du moment où les cellules sont transférées à 37 °C. Des anticorps anti-CD81 inhibent l' infection des VHCpp et VHCcc lorsqu' ils sont ajoutés pendant l' attachement du virus à 4 °C ou à partir du moment où les cellules sont transférées à 37 °C ( Cormier et al. , 2004b ; Evans et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Morikawa et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . De plus , l' ajout d' anticorps anti-CD81 jusqu'à 1h après le transfert des cellules à 37 °C permet d' inhiber l' infection des VHCcc ( Evans et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2006 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , la t 1 / 2 des anticorps anti-CD81 pour inhiber l' interaction entre CD81 et les VHCpp et VHCcc est de 17 et 18 minutes , respectivement ( Bertaux and Dragic , 2006 ; Evans et al. , 2007 ) . Par ailleurs , les anticorps anti-CD81 sont capables d' inhiber 50 % de l' infection des VHCcc lorsqu' il sont ajoutés 1 heure après le transfert des cellules à 37 °C , indiquant que 50 % des particules virales sont déjà entrées dans les cellules après 1h d' incubation à 37 °C ( Koutsoudakis et al. , 2006 ) . Le niveau d' expression de CD81 et l' entrée virale La susceptibilité de cellules à l' infection par le VHC est étroitement liée au niveau d' expression de CD81 à leur surface ( Akazawa et al. , 2007 ; Koutsoudakis et al. , 2007 ) . Koutsoudakis et collaborateurs ont utilisé les cellules hépatocytaires Huh- 7.5 et Huh- 7 -Lunet . Bien que ces cellules soient hautement permissives à la réplication de l' ARN viral des réplicons , elles présentent des niveaux différents d' infection par les VHCcc . En effet , le faible niveau de permissivité des cellules Huh- 7 -Lunet était lié à un niveau insuffisant d' expression de CD81 à la surface cellulaire . Cette étude suggère qu' un seuil d' expression de CD81 doit être limitant pour permettre l' infection par le VHC . Leurs données indiquent que les cellules qui expriment des niveaux indétectables ou faibles de CD81 à la surface sont peu ou pas infectables , tandis qu' à partir d' un certain seuil d' expression de CD81 ( 7 x 104 molécules / cellule ) , la susceptibilité à l' infection augmente rapidement . A partir d' un certain niveau d' expression de CD81 , l' infectiosité n' augmente plus , suggèrant que d' autres facteurs limitent probablement l' infection ( Koutsoudakis et al. , 2007 ) . Une autre étude , réalisée par Akazawa et collaborateurs , a analysé des clones cellulaires individuels issus de la dilution limite de cellules Huh- 7 . D' une manière générale , les clones négatifs pour CD81 étaient également négatifs pour l' infection par les VHCcc ; par contre , les clones positifs pour CD81 présentaient des niveaux différents de permissivité au VHC . Toutefois , l' hétérogenéité des différents clones cellulaires par rapport à la réplication de l' ARN viral , l' infectiosité et l' expression de CD81 suggèrait que d' autre ( s ) facteur ( s ) , en plus de CD81 , participent à la permissivité cellulaire au VHC ( Akazawa et al. , 2007 ) . CD81 , la composition lipidique membranaire et l' entrée virale La teneur en cholestérol de la membrane plasmique est également importante pour l' entrée du VHC ( Kapadia et al. , 2007 ; Lavillette et al. , 2006 ) . Il a été montré que le traitement des cellules avec la methyl- ? -cyclodextrine ( M ? CD ) , une drogue qui extrait le cholestérol membranaire , induit une inhibition de l' infection par le VHC ( Kapadia et al. , 2007 ) . Cette inhibition est directement liée à la diminution de la quantité de CD81 à la surface ( Kapadia et al. , 2007 ) , car CD81 interagit physiquement avec le cholestérol ( Charrin et al. , 2003c ) . De plus , le réapprovisionnement des cellules en cholestérol après leur traitement avec cette drogue permet la restauration de l' infection et des niveaux d' expression de CD81 ( Kapadia et al. , 2007 ) . Curieusement , le traitement des cellules avec la M ? CD augmente l' expression de SR-BI dans les cellules , indiquant que l' importance de cette molécule dans l' infection doit être secondaire par rapport au rôle joué par CD81 , ou alors les niveaux d' expression de surface des deux protéines nécessaires à l' infection pourraient être différents ( Kapadia et al. , 2007 ) . L' expression de CD81 à la surface cellulaire est également régulée par la composition lipidique membranaire . Les sphingolipides sont importants pour l' organisation de la membrane plasmique et ils s' associent avec le cholestérol pour former des microdomaines enrichis en lipides ( lipid rafts ) . La transformation des sphingomyélines en céramides par la sphingomyelinase , enzyme présente à la surface cellulaire , influence l' entrée de certains virus . Pour le VHC , il a été montré que l' enrichissement de la membrane en céramides induit l' internalisation de CD81 , inhibant l' entrée virale ( Voisset et al. , 2007 ) . Les tétraspanines s' organisent à la membrane plasmique dans des microdomaines spécifiques différents des rafts et le cholestérol contribue à l' organisation de ces microdomaines . Les céramides pourraient alors modifier la distribution de ces microdomaines à la surface cellulaire . Le rôle de CD81 dans l' étape d' entrée du VHC Bien que l' implication de CD81 dans le processus d' entrée virale soit clairement établi ( Figure 11 ) , son rôle spécifique n' est pas encore défini . La tétraspanine CD81 pourrait contribuer à la fusion membranaire , puisque cette molécule participe à des evénements de fusion dans la différentiation des myoblastes ( Tachibana and Hemler , 1999 ) et la tétraspanine CD9 joue un rôle important dans la fusion entre les ovocytes et les spermatozoïdes pendant la fertilisation ( Le Naour et al. , 2000 ) . CD81 pourrait également être impliquée dans des voies de signalisation intracellulaire qui seraient responsables de l' induction des mécanismes d' entrée virale . Par ailleurs , l' expression tissulaire de CD81 est presque ubiquitaire , alors que le tropisme du VHC est principalement restreint aux cellules hépatiques . De plus , certaines lignées hépatocytaires exprimant CD81 ne sont pas permissives aux virus ( Bartosch et al. , 2003d ; Cormier et al. , 2004b ; Hsu et al. , 2003 ; Lavillette et al. , 2005b ) . L' ensemble de ces résultats indique que CD81 est une protéine nécessaire , mais pas suffisante pour l' entrée du VHC . Un ou plusieurs facteurs de l' hôte , encore non identifiés , serait ( aient ) indispensable ( s ) pour le déroulement de cette étape du cycle viral . 2.2.2 . Le scavenger récepteur classe B de type I ( SR-BI ) Le SR-BI est une protéine exprimée à la surface de nombreux tissus et types cellulaires , particulièrement dans le foie et les tissus stéroïdogéniques ( Connelly and Williams , 2003 ; Rhainds et al. , 2004 ) . Cette protéine traverse deux fois la membrane plasmique , avec les extrémités N- et C-terminales cytoplasmiques et une boucle extracellulaire , présentant neuf sites potentiels de N-glycosylation ( Figure 14 ) ( Rhainds and Brissette , 2004 ) . SR-BI est un récepteur à ligands multiples incluant les LDL acétylées et oxydées et les lipoprotéines de haute densité ( HDL ) ( Acton et al. , 1996 ) . L' incorporation cellulaire des lipoprotéines par SR-BI s' effectue en deux étapes : l' attachement au récepteur et le transfert des lipides ( Connelly and Williams , 2003 ; Rhainds and Brissette , 2004 ) . Ainsi , SR-BI intervient dans le métabolisme lipidique de la cellule . En utilisant la forme sE 2 , Scarselli et collaborateurs ont identifié SR-BI comme un récepteur potentiel du VHC ( Scarselli et al. , 2002 ) . Son rôle dans l' infection virale a été demontré par l' utilisation de VHCpp et VHCcc ( Bartosch et al. , 2003c ; Kapadia et al. , 2007 ; Lavillette et al. , 2005b ; Voisset et al. , 2005 ) . Des anticorps anti-SR-BI inhibent l' interaction de sE 2 , des VHCpp et des VHCcc avec SR-BI ( Bartosch et al. , 2003d ; Catanese et al. , 2007 ; Kapadia et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Des anticorps dirigés contre les lipoprotéines spécifiques inhibent également l' interaction entre SR-BI et le virus , mais pas des anticorps dirigés contre les glycoprotéines E1 et E2 ( Maillard et al. , 2006 ) . L' infection en absence de lipoprotéines peut aussi être inhibée par des anti-SR-BI ( Catanese et al. , 2007 ) . Lorsque l' utilisation d' ARN interférents dirigés contre SR-BI permet une réduction efficace de l' expression de SR-BI à la surface des cellules hépatocytaires , l' infection est fortement inhibée ( Lavillette et al. , 2005b ; Voisset et al. , 2005 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Par ailleurs , la surexpression de SR-BI et SR-BII ( une isoforme de SR-BI ) peut augmenter le niveau d' infection de cellules cibles par des VHCcc ( Grove et al. , 2007 ) , et il semblerait que la région HVR1 de E2 soit nécessaire à la reconnaissance de SR-BI ( Barth et al. , 2005 ; Bartosch et al. , 2003c ; Scarselli et al. , 2002 ) . Figure 14 . La structure de la protéine SR-BI . SR-BI est constituée d' une grande boucle extracellulaire , de deux passages transmembranaires avec deux queues cytoplasmiques . La boucle extracellulaire contient neuf sites potentiels de glycosylation ( en vert ) et six cystéines ( en violet ) . SR-BI est palmitoylée au niveau de deux cystéines localisées à l' extrémité C-terminale ( d' après Cocquerel et al. , J. Gen . Virol . 2006 ) . SR-BI est un récepteur des HDL et des LDL acétylées et oxydées . Les LDL oxydées sont capables d' inhiber l' infection des VHCpp et VHCcc ( von Hahn et al. , 2006 ) . Au contraire , les HDL peuvent faciliter l' entrée des VHCpp et VHCcc , de manière dépendante de la capacité de transfert lipidique de SR-BI ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) . Les HDL sont également capables de réduire la neutralisation de l' infection des VHCpp et VHCcc par des anticorps dirigés contre E2 ou des anticorps purifiés à partir de sérum de patients infectés ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Lavillette et al. , 2005a ; Meunier et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2006 ) . L' augmentation de l' infectivité des VHCpp induite par les HDL est dépendante de l' interaction entre la région HVR1 de E2 et SR-BI ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) et les résidus L339 et G406 de cette région semblent être impliqués ( Bartosch et al. , 2005 ) . L' effet stimulateur des HDL se fait par une stimulation de l' activité de transfert lipidique de SR-BI , car des drogues qui réduisent cette capacité de transfert , comme la BLT- 4 , annulent l' effet des HDL sur l' infection des VHCpp et VHCcc ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2006 ) . Cependant , les HDL n' interagissent pas directement avec les particules virales ( Bartosch et al. , 2005 ; Dreux et al. , 2006 ; Voisset et al. , 2005 ) . Les HDL sont formées par des lipides associés à des apolipoprotéines , mais l' utilisation des apolipoprotéines A-I et A-II libres de lipides n' a pas d' effet sur l' infection des VHCpp et des anticorps polyclonaux dirigés contre les apolipoprotéines A-I , A-II , C-II et C-III n' annulent pas l' effet des HDL ( Bartosch et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2005 ) . Inversement , il a été proposé que l' apolipoprotéine C1 serait un des composants responsables de l' interaction des HDL avec les particules virales ( Dreux et al. , 2007 ; Meunier et al. , 2005 ) . Par ailleurs , SR-BI peut également interagir avec l' apolipoprotéine serum amyloïde A ( SAA ) et l' internaliser ( Baranova et al. , 2005 ; Cai et al. , 2005a ) . La SAA est une protéine produite principalement dans le foie après une infection , un dommage tissulaire ou une inflammation ( Uhlar and Whitehead , 1999 ) , suggérant un rôle bénéfique dans la protection de l' hôte . De façon intéressante , la SAA inhibe l' entrée des VHCpp et VHCcc , en interagissant avec les particules virales , en système VHCpp ( Cai et al. , 2007 ; Lavie et al. , 2006 ) . L' ensemble de ces observations confirme l' implication de SR-BI dans l' entrée du VHC ( Figure 11 ) . Cependant , sa présence dans d' autres tissus ne permet pas d' expliquer le tropisme hépatique du virus . D' autre part , il a été montré que l' étape de l' entrée du VHC au cours de laquelle SR-BI interviendrait se produirait après l' attachement du virus aux cellules cibles ( Bartosch et al. , 2005 ; Voisset et al. , 2005 ) . Récemment , Evans et collaborateurs ont montré que les VHCcc s' associent aux cellules non hépatocytaires CHO exprimant SR-BI , mais non pas aux cellules CHO exprimant CD81 ou la Claudine 1 , suggérant que SR-BI pourrait intervenir avant CD81 dans le processus d' entrée ( Evans et al. , 2007 ) . Plus spécifiquement , il semblerait que la participation de SR-BI et CD81 dans l' entrée virale est intimement liée et a lieu pendant la première heure de l' infection , puisque les temps d' inhibition de l' infection des VHCcc par des anticorps anti-SR-BI et anti-CD81 sont similaires ( Zeisel et al. , 2007 ) . De plus , l' inhibition de l' infection induite par la co-incubation des cellules avec les deux types d' anticorps , en comparaison à des cellules incubées avec ces anticorps séparement , est encore plus importante , suggérant que SR-BI et CD81 coopérent pendant une étape post-attachement de l' entrée du VHC ( Kapadia et al. , 2007 ; Zeisel et al. , 2007 ) . Des anti-CD81 et anti-SR-BI sont également capables d' inhiber l' entrée des VHCpp , toutefois il n' y a pas d' effet coopératif en combinaison des deux , suggérant que la coopération de SR-BI et CD81 observée pour l' inhibition de l' infection des VHCcc se passe probablement pendant une étape post-entrée ( Kapadia et al. , 2007 ) . Cette étude montre que des différences existent entre les mécanismes d' entrée des VHCpp et VHCcc . Jusqu'à présent , aucune interaction directe entre les dimères E1E2 et SR-BI n' a été décrite , suggérant que l' association du VHC avec SR-BI n' est pas directement liée à E2 , mais se fait probablement par les lipoprotéines associées aux virions . Cette molécule étant capable d' internaliser ses ligands , le virus pourrait ainsi exploiter l' activation physiologique de SR-BI par les lipoprotéines pour être endocyté ( Connelly and Williams , 2003 ; Rhainds and Brissette , 2004 ) . 2.2.3 . Les molécules des jonctions serrées Claudines Récemment , une banque d' ADNc de cellules hépatiques humaines a été utilisée dans le but de trouver un récepteur spécifique du VHC . Cette approche a permis l' identification d' un nouveau cofacteur nécessaire à l' entrée du virus , la Claudine- 1 , une protéine des jonctions serrées ( Figure 15 ) ( Evans et al. , 2007 ) exprimée principalement dans le foie ( Furuse et al. , 1998 ) . Cet organe exprime également d' autres claudines ( Rahner et al. , 2001 ) . Figure 15 . La structure des Claudines , protéines de jonctions serrées . Les claudines sont constituées de quatre passages transmembranaires , une courte séquence intracellulaire N-terminale , deux domaines extracellulaires ( EL1 et EL2 ) et une queue intracellulaire C-terminale qui peut être phosphorylée et qui permet l' interaction avec d' autres protéines par son motif PDZ . Les jonctions serrées assurent l' étanchéité des épithéliums . Elles constituent un rapprochement étroit et localisé des membranes de deux cellules voisines , limitant le passage des solutés à travers l' espace intercellulaire ( Aijaz et al. , 2006 ; Schneeberger and Lynch , 2004 ) . Les claudines sont les composants les plus importants des jonctions serrées . Ces protéines présentent quatre TMD , deux boucles extra-cellulaires et leurs extrémités N- et C-terminales sont dirigées vers le cytoplasme . Les domaines extracellulaires sont responsables de la perméabilité de la barrière en formation et la queue C-terminale , qui contient un motif PDZ d' interaction avec d' autres protéines , est responsable de l' ancrage au cytosquelette ( Gonzalez-Mariscal et al. , 2003 ; Van Itallie and Anderson , 2006 ) . Ces protéines jouent un rôle crucial dans la régulation de la dynamique des flux paracellulaires et dans la maintenance de la polarité cellulaire ( Gumbiner , 1993 ) . La concentration et le type de claudines d' une jonction serrée dans un type cellulaire donné déterminent la force de la sélection de la barrière . Certaines de ces protéines ont déjà été impliquées dans l' infection par d' autres virus : le récepteur aux coxsackievirus et aux adénovirus ( CAR ) , impliquée dans l' entrée de ces deux virus , et la molécule d' adhésion des jonctions ( JAM ) , importante pour l' infection des réovirus , comme les rotavirus par exemple . Pour le VHC , il a été montré que la Claudine- 1 ( CLDN- 1 ) est exprimée dans différentes lignées d' hépatocarcinome et est nécessaire à l' entrée des VHCpp et VHCcc ( Evans et al. , 2007 ; Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) ( Figure 11 ) . La réduction de l' expression de CLDN- 1 dans les cellules hépatiques par des ARN interférents entraîne une diminution de l' infection par des VHCpp et VHCcc , mais la surexpression de CLDN- 1 n' augmente pas l' infectiosité ( Evans et al. , 2007 ) . Des anticorps dirigés contre un épitope inséré dans la première boucle extracellulaire de la CLDN- 1 sont également capables de bloquer l' infection par le VHC de façon dose-dépendante ( Evans et al. , 2007 ) . Des cinétiques d' inhibition suggèrent que la CLDN- 1 agit plus d' une heure après la fixation du virus sur les cellules , avec une t 1 / 2 d' inhibition de l' infection par les VHCcc de 73 minutes , indiquant que cette molécule agit après SR-BI et CD81 dans l' entrée virale ( Evans et al. , 2007 ) . De plus , il a été montré que CLDN- 1 s' associe à CD81 et LDL-R à la membrane plasmique et dans le cytoplasme des cellules , et que lorsqu' elle est surexprimée , elle interagit également avec E1 et E2 du VHC ( Harris et al. , 2008 ; Yang et al. , 2008 ) . La CLDN- 1 est capable de s' associer aux tétraspanines CD81 et CD151 , probablement d' une manière indirecte via son interaction avec la tétraspanine CD9 ( Kovalenko et al. , 2007 ) . Par ailleurs , d' autres claudines , comme les CLDN- 6 et - 9 , semblent également être impliquées dans l' infection par le VHC ( Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) . Toutefois , bien que les ARN messagers des CLDN- 6 et - 9 soient présents dans des lignées hépatocytaires et dans les PBMCs ( Meertens et al. , 2008 ; Zheng et al. , 2007 ) , aucune expression protéique n' a été détectée dans les lignées hépatocytaires analysées ( Meertens et al. , 2008 ) . De manière intéressante , l' expression de CLDN- 1 dans certaines lignées non-hépatiques , telles que les HEK-293T et SW13 , les rend permissives à l' infection par les VHCpp et VHCcc ( Evans et al. , 2007 ; Yang et al. , 2008 ) et l' expression des CLDN- 1 , - 6 et - 9 présente le même effet pour l' infection par des VHCpp de différents génotypes ( Meertens et al. , 2008 ) . Ainsi , c' est la première fois que l' expression d' une protéine permet de rendre des cellules non-hépatiques permissives au VHC . L' entrée des VHCpp dans les cellules HEK-293T exprimant les CLDN- 1 , - 6 ou - 9 peut être inhibée par du sérum de patient VHC positif , par un anticorps anti-CD81 et par la diminution de l' acidité des endosomes via le traitement des cellules par la bafilomycine A1 ( Meertens et al. , 2008 ) , suggèrant que l' expression des CLDN ne modifie pas l' importance de CD81 et de l' acidification endosomal pour l' infection . La majorité des claudines présente une grande homologie de séquence en acides aminés , spécialement les CLDN- 6 et - 9 , qui différent d' un seul acide aminé . Ces protéines sont phylogénétiquement plus proches des claudines 3 et 4 , et la CLDN- 1 est plus proche de la claudine 7 ( Zheng et al. , 2007 ) . Les homologies de séquences ne peuvent donc pas expliquer la capacité des CLDN- 1 , - 6 et - 9 à conférer l' entrée au VHC , indiquant qu' un motif tridimensionnel ou l' interaction avec d' autres composants cellulaires pourraient permettre l' infection ( Meertens et al. , 2008 ) . Par contre , l' alignement des séquences en acides aminés des CLDN- 3 , - 6 et - 9 humaines ont permis l' identification de quatre résidus pouvant jouer un rôle dans l' entrée virale . Néanmoins , bien que la claudine 3 présente une grande homologie de séquence avec les CLDN- 6 et - 9 , elle n' est pas capable de conférer une sensibilité au VHC dans les cellules HEK-293T. Les études par mutagenèse de ces quatres positions indiquent que les résidus N38 et V45 de la CLDN- 9 sont importants pour l' entrée des VHCpp ( Zheng et al. , 2007 ) . De plus , les positions I32 et E48 , critiques pour l' infection par le VHC dans les cellules qui expriment la CLDN- 1 ( Evans et al. , 2007 ) , sont également importantes pour la CLDN- 9 ( Zheng et al. , 2007 ) . D' autre part , Meertens et collaborateurs ont exprimé les CLDN- 1 , - 6 et - 9 dans deux lignées hépatocytaires , H 1H et NKNT3 . Ces lignées expriment