test fonctionnel de mesure des activités enzymatiques de réparation de l'ADN par excsion resynthèse sur support miniaturisé: mise au point et applications
Scientext
Projet ORFEO © 2015 CNRS
Corpus Scientext
Le projet Scientext a permis de constituer un corpus de textes scientifiques consultable en ligne d’environ 4,8 millions de mots en français. Le corpus a été annoté au niveau de l’en-tête (méta-données sur l’annotation et l’origine du corpus), au niveau de la structure (parties de l’article) et au plan morphologique et syntaxique à l’aide du logiciel Syntex développé par Didier Bourigault, et en respectant les recommandations XML et TEI en vigueur. Il est consultable en ligne. Ce projet a fait collaborer des équipes pluridisciplinaires de chercheurs en linguistique, linguistique informatique et didactique .
Métadonnées : general
| Corpus | Scientext 2010 |
| Nom du fichier | test fonctionnel de mesure des activités enzymatiques de réparation de l'ADN par excsion resynthèse sur support miniaturisé: mise au point et applications |
| Responsable(s) | Agnès TUTIN et Francis GROSSMANN |
| Niveaux d'annotation | Annotation automatique |
| Annotation | automatique |
| Type | écrit scientifique |
| Sous-type de texte | thèse |
| Modalité | écrit |
| Adresse d'échantillon | /annis-sample/scientext/these_95_bio_millau.html |
Texte
| _: | THESE Présentée par Jean-François MILLAU Pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L' UNIVERSITE JOSEPH FOURIER GRENOBLE 1 Ecole Doctorale Ingénierie pour la Santé , la Cognition et l' Environnement Discipline : Biotechnologie Directeur de thèse : Sylvie Sauvaigo Date de soutenance : 15 Novembre 2006 Jury : Thèse préparée au sein du laboratoire Lésions des Acides Nucléiques SCIB / DRFMC / Commissariat à l' Energie Atomique de Grenoble Remerciements En premier lieu , je tiens à remercier le professeur Christian Brambilla , le professeur Charles Dumontet , Jaime Angulo , et Thierry Oddos pour avoir accepté d' être membres de mon jury et d' avoir évalué mon travail de thèse . Je suis très reconnaissant envers Sylvie Sauvaigo pour m' avoir encadré et permis de réaliser mon stage de DEA ainsi que ma thèse au LAN , et je la remercie pour avoir su être toujours disponible . Je remercie également le professeur Alain Favier pour avoir toujours été présent aux différents tournants de mon cursus universitaire , du magistère au DEA en passant par la thèse . Je remercie Thierry Douki pour avoir réalisé les dosages CLHP-SM / SM des lésions , et pour ses corrections avisées de mon manuscrit de thèse ainsi que pour son aide quant à l' utilisation de Word sur un document dépassant cent pages . Je suis également reconnaissant envers Jean-Luc Ravanat pour son aide précieuse concernant le dosage des lésions , mais aussi pour avoir été de très bon conseil lors de la préparation de mon oral de thèse . Je le remercie aussi pour avoir su dompter les bugs informatiques les plus récalcitrants . Je remercie Jean Breton ( le Mangeur Masqué ) pour tous ses conseils et contributions qui m' ont beaucoup aidé pour réaliser la partie de ce manuscrit se rapportant à la cancérologie . Je le remercie aussi pour avoir été mon premier auditeur lors de la préparation de mon oral de thèse . Je remercie Jean Cadet pour ses conseils et les discussions toujours enrichissantes que nous avons eues . Je suis reconnaissant envers la société Johnson & Johnson et notamment Thierry Oddos qui , les premiers , ont cru en ce projet et nous ont permis d' avoir les fonds nécessaires à son bon développement . Je remercie Sylvie Chevillard et Marie-Françoise Olivier du Laboratoire de Cancérologie Expérimentale du CEA Fontenay-aux-Roses pour avoir accepté de collaborer avec nous et nous avoir permis de réaliser les expériences d' adaptation cellulaire au rayonnement gamma . Je remercie Nicolas Ugolin et Guillaume Arras également du Laboraoire de Cancérologie Expérimentale pour le fantastique travail qu' ils ont accompli concernant la normalisation des données ainsi que pour la mise au point du logiciel NormelizeIt . Je remercie Béatrice Schaak et Julien Reboud du Laboratoire des Biopuces du CEA Grenoble pour nous avoir permis de réaliser les dépôts de nos premières biopuces à l' aide de leur robot de dispense . Je remercie Didier Grunwald du Département de Réponse et Dynamique Cellulaires du CEA Grenoble pour nous avoir permis de réaliser l' étude au microscope confocal de notre support . Je tenais à dire un grand merci à Sylvain Caillat sans qui tout ce travail n' aurait pu être accompli , je tiens également à le remercier pour tous les bons moments que nous avons passés ensemble durant ces quatres années . Je remercie Caroline Marie pour nos longues conversations « philosophiques » cela a été un vrai plaisir de partager le bureau en sa compagnie . Je remercie également Peggy Regulus pour sa bonne humeur , pour m' avoir initié aux notions de mode et coordination , mais aussi pour notre soutien mutuel de doctorants . Un merci à Olivier Falletti pour les discussions concernant des sujets scientifiques mais aussi musicaux , ce fut un plaisir de jouer quelques morceaux avec lui . Je tiens aussi à remercier Zorha Termache pour son professionnalisme hors pair qui permet de naviguer dans les méandres administratifs auxquels est enclin le CEA . Un grand merci également à tous les autres membres du laboratoire avec qui ce fut un réel plaisir de travailler : Stéphane , Anne-Laure , Francette , Christine , Didier , Sandra , Alexia , Karine , Sandrine , Jocelyne ... Pour finir je tiens à remercier mes parents pour leur soutien indéfectible tout au long de mon cursus universitaire ; et je tiens à dire grand merci à Delphine qui m' a supporté au sens propre comme au sens figuré et qui a permis à ce manuscrit de ne pas être entaché par un grand nombre de malencontreuses fautes d' orthographe . Etude bibliographique 1 I ) Les systèmes de réparation 4 A ) La réparation par excision de nucléotides ( REN ) 6 1 ) Découverte et historique 6 2 ) Le fonctionnement mécanistique de la réparation par excision de nucléotides 7 3 ) Voie de signalisation et régulation de la REN 12 B ) La réparation par excision de base ( REB ) 16 1 ) Découverte et historique 16 2 ) Le mécanisme de la réparation par excision de base 17 3 ) La réparation par excision de base couplée à la transcription 21 4 ) La régulation de la réparation par excision de base 22 C ) Les autres systèmes de réparation 24 1 ) Les systèmes de réparation des cassures de l' ADN 24 2 ) Les polymérases translésionelles 26 3 ) La réparation des mésappariements et des insertions / délétions 27 4 ) Les alkyltransférases 28 D ) Complémentarités et interactions des systèmes de réparation 30 E ) Régulation par translocation nucléaire des protéines de réparation 31 F ) Dommages de l' ADN et cycle cellulaire 32 II ) Les maladies impliquant les systèmes de réparation 34 A ) Implication des systèmes de réparation dans le processus de carcinogenèse et de résistance aux traitements de chimiothérapie et radiothérapie 34 1 ) Implication de la réparation de l' ADN dans le processus de carcinogenèse 34 2 ) Implication de la réparation de l' ADN dans le phénomène de résistance au traitement par chimiothérapie et radiothérapie 37 3 ) Effets secondaire liés aux traitements par chimiothérapie et radiothérapie 43 4 ) Conclusion 44 B ) Les maladies génétiques liées à des gènes impliqués dans la réparation 45 1 ) Xeroderma pigmentosum pigmentosum 45 2 ) Le syndrome de Cockayne 48 3 ) Trichothiodystrophie ( TTD ) 51 4 ) Le cancer du colon héréditaire non-polyposique ( CCHNP ) 52 5 ) Réparation de l' ADN et polymorphisme génétique 53 C ) Conclusion sur les maladies liées à la réparation de l' ADN 57 III ) Les outils permettant d' étudier la réparation de l' ADN 58 A ) Etude de la réparation : mesure des activités enzymatiques 58 1 ) Méthodes indirectes basées sur la mesure des lésions 58 2 ) Les méthodes de mesure directe des activités enzymatiques de réparation 64 3 ) Conclusion 70 B ) Mesure de la réparation : les biopuces 70 1 ) L' étude du transcriptome au moyen de biopuces 70 2 ) Les puces à anticorps 73 C ) Conclusion sur les outils permettant d' étudier la réparation 76 Objectifs de la thèse 77 Partie expérimentale 81 Chapitre I : Mise au point de la fabrication de la biopuce 85 I ) Les différentes lésions présentes sur la biopuce 88 A ) L' ADN portant les lésions 88 B ) Préparation des plasmides portant les lésions 88 1 ) La qualité des plasmides 88 2 ) La qualité des lésions 89 3 ) Choix du nombre de lésions par plasmide 89 C ) Les différents plasmides présents sur la biopuce 90 1 ) Plasmide contrôle 90 2 ) Plasmide portant les dimères de cyclobutane de pyrimidine et les photoproduits ( 6 - 4 ) 90 3 ) Les plasmides portant des produits d' oxydation de bases 92 4 ) Plasmide portant des bases alkylées 94 5 ) Les plasmides portant des pontages 96 6 ) Plasmide portant des sites abasiques 97 D ) Organisation des dépôts sur la biopuce 98 II ) Réalisation des dépôts à l' aide du robot de dispense 100 A ) Le robot de dispense ScieFlexarrayer 100 1 ) Présentation du robot et caractéristiques techniques 100 2 ) Fonctionnement du robot 100 3 ) La technologie de dispense piézoélectrique 102 B ) Mise au point des paramètres de dépôt 103 1 ) Le lavage de la buse de dispense 103 2 ) Choix du nombre de gouttes par dépôt 105 3 ) Choix du volume de prélèvement 107 4 ) Conditionnement de la buse de dispense et reproductibilité 109 III ) Le support utilisé pour réaliser la biopuce 109 A ) Lames de Poly-L-Lysine ou lames Hydrogel 110 1 ) Morphologie des dépôts 110 2 ) Signal de réparation obtenu 111 3 ) Conservation des plasmides sur le support 113 4 ) Conclusion 116 B ) Analyse par microscopie confocale du support 116 1 ) Présentation de la microscopie confocale 117 2 ) Localisation des plasmides et de la réparation dans l' Hydrogel 118 3 ) Conclusion 120 C ) Fabrication de lames hydrogel 121 1 ) Problèmes rencontrés avec les lames Perkin Elmer 121 2 ) Mise au point de lames hydrogel 121 IV ) Conclusion 125 Chapitre II : Mise au point de la quantification de la fluorescence , de la normalisation des données et de l' analyse des résultats 127 I ) Quantification de la fluorescence 130 A ) Lecture des biopuces et reconnaissance des dépôts 130 B ) Choix de la méthode de mesure de la fluorescence des dépôts 132 II ) Normalisation des données 135 III ) Analyse des résultats 138 IV ) Conclusion 140 Chapitre III : Mise au point des conditions de réaction du test et de la préparation des extraits cellulaires 141 I ) Mise au point des conditions de réaction du test 144 A ) La composition de la solution de réparation 144 1 ) Effets de la concentration en MgCl 2 144 2 ) Effet de la concentration en Dithiothreitol ( DTT ) 147 3 ) Effet de la concentration en HEPES 147 4 ) Effet de la concentration en EDTA 148 5 ) Effet de la concentration en ATP 148 B ) Effet de la concentration en extrait 151 C ) Cinétique de réparation 152 D ) Conclusion 153 II ) Préparation des extraits cellulaires 153 A ) Précautions quant à la préparation des extraits cellulaires 154 B ) Extraits cellulaires totaux 154 1 ) Le principe de la préparation des extraits totaux 154 2 ) Résultats obtenus avec les extraits totaux 156 C ) Extraits cellulaires nucléaires 158 1 ) Le principe de la préparation des extraits nucléaires 158 2 ) Résultats obtenus avec les extraits nucléaires 159 3 ) Optimisation de la préparation des extraits 162 III ) Conclusion 165 Chapitre IV : Validation du test 167 I ) Validation biochimique 169 A ) Mise en évidence des activités de la REB et de la de la REN 169 1 ) Effet de la concentration en ATP 169 2 ) Inhibition des polymérases epsilon et delta ( & 206;& 181; / & 206;& 180; ) 173 3 ) Conclusion 175 B ) Inhibition par compétition 175 C ) Inhibition des réactions enzymatiques à l' aide d' anticorps 177 II ) Validation biologique du test 177 III ) Conclusion 179 Chapitre V : Expériences applicatives 181 I ) Etude des profils de réparation de différents types cellulaires 183 A ) Fonction et localisation des cellules étudiées 184 1 ) Les cellules de la peau : fibroblastes et kératinocytes 184 2 ) Les cellules mononuclées du sang périphérique 185 B ) Comparaison de profils de réparation cellulaire 185 1 ) Comparaison des profils de réparation de trois cultures primaires de fibroblastes 185 2 ) Comparaison des activités de réparation de fibroblastes et de kératinocytes 187 3 ) Activités de réparation des cellules mononuclées du sang périphérique ( CMSP ) 189 C ) Conclusion 191 II ) Etude de l' effet de doses adaptatives de rayonnement gamma sur les activités de réparation cellulaires 191 A ) Le rayonnement gamma et l' adaptation cellulaire 191 1 ) Le rayonnement gamma ( & 206;& 179; ) 191 2 ) Effet du rayonnement gamma sur l' ADN 192 3 ) L' adaptation cellulaire 193 B ) Expérience d' adaptation cellulaire 195 4 ) Conclusion 200 III ) Conclusion 201 Conclusion et perspectives 203 Matériels et méthodes 211 I ) Préparation des plasmides 213 A ) Amplification et purification du plasmide contrôle pBluescript 213 B ) Préparation des différents plasmides comportant les lésions 213 1 ) Le plasmide pCPD- 64 213 2 ) Le plasmide pCPD- 64 * 213 3 ) Le plasmids p 8 oxo 214 4 ) Le plasmide p 8 oxo * 214 5 ) Le plasmide pAlkB 214 6 ) Le plasmide pCisP 214 7 ) Le plasmide pPso 215 8 ) Le plasmide pAbaS 215 9 ) Le plasmide pThymG 215 C ) Purification des plasmides traités 216 II ) Quantification des lésions 216 A ) Digestion des plasmides 216 B ) Dosage des lésions 217 1 ) Par CLHP-SM / SM 217 2 ) Dosage CLHP couplé à un détecteur électrochimique 218 3 ) Dosage des sites abasiques par électrophorèse sur gel d' agarose 218 4 ) Résultats de la quantification des lésions des différents plasmides 218 III ) Réalisation des dépôts de plasmides 219 A ) Dispense des solutions de plasmides 219 B ) Support utilisés 219 1 ) Supports commerciaux 219 2 ) Lame hydrogel mise au point au laboratoire 220 IV ) Etude en microscopie confocale du support 221 A ) Marquage de plasmides par « nick-translation » ( pCy 3 ) 221 B ) Réalisation des dépôts 221 C ) Réaction de réparation 222 D ) Observation au microscope confocal 222 V ) Culture cellulaire 222 A ) Obtention des cellules 222 1 ) Fibroblastes et kératinocytes 222 2 ) CMSP 222 B ) Culture des cellules 223 1 ) Cellules HeLa 223 2 ) Fibroblastes 223 3 ) Kératinocytes 223 C ) Conservation des cellules 223 VI ) Extraits cellulaires 224 A ) Extraits totaux 224 B ) Extraits nucléaires 224 VII ) Test de réparation par excision resynthèse 225 VIII ) Lecture biopuces , normalisation et analyse des données 226 A ) Lecture des biopuces 226 B ) Normalisation des données 226 C ) Analyse des données 227 Références Bibliographiques 229 Annexes 251 Abréviations : Etude bibliographique Introduction : Qu' est ce que le vivant ? Une définition simple pourrait être : toute entité biologique présentant la capacité de se reproduire . Cette définition très large permet d' englober les procaryotes mais aussi les plus complexes des organismes eucaryotes pluricellulaires . Tous deux , pour se reproduire , ont le même besoin de transmettre de l' information à leur descendance . La nature , à travers l' évolution , a notamment trouvé comme solution à ce problème l' acide désoxyribonucléique ( ADN ) . Cette molécule en double hélice , composée de quatre bases A , T , G et C , est le support de l' information génétique . Son rôle est essentiel car elle contient tout le programme nécessaire au déroulement de la vie cellulaire . Mais l' ADN est constamment endommagé par des agents endogènes ( par exemple les espèces réactives de l' oxygène ) et exogènes ( le rayonnement ultraviolet , les polluants ) , qui modifient sa structure chimique et par conséquent l' information qu' il contient . Au cours de l' évolution , des systèmes de réparation ont fait leur apparition , permettant aux êtres vivants de maintenir en partie l' intégrité de leur génome . Il faut cependant souligner le fait que la réparation de l' ADN est imparfaite . Cela a permis aux êtres vivants d' évoluer en permettant un certain degré de liberté dans les séquences d' ADN génomiques . Nous allons aborder dans cette étude bibliographique la description des différents systèmes de réparation présents dans les cellules humaines . Nous aborderons la complexité de ces mécanismes , notamment le fait que certains d' entre eux se recouvrent mais aussi se complètent . Nous parlerons ensuite des maladies génétiques et acquises qui découlent de défauts de la réparation de l' ADN . Enfin seront présentés les outils utilisés pour étudier la réparation de l' ADN . I - Les systèmes de réparation Au sein de la cellule , l' ADN peut être endommagé et subir des modifications chimiques . Ces modifications peuvent avoir des origines diverses que l' on peut cependant classer en trois groupes . - Les modifications de l' ADN créées par des facteurs exogènes : On trouve dans cette catégorie les rayonnements ionisants qui provoquent principalement des cassures double et simple brin de l' hélice d' ADN , mais aussi les rayonnements UV qui conduisent à la formation de dimères cyclobutane de pyrimidine ( DCP ) et de la 8- oxogunine ( 8- oxoG ) par l' action des UVA , et à la formation de DCP et de photoproduits ( 6 - 4 ) ( pp ( 6 - 4 ) ) par l' action des UVB . Des produits chimiques , dont certains ont été utilisés dans le traitement de cancers , peuvent également être la source de modifications de la structure de l' ADN : les agents alkylants ( diméthyle sulfate ) , les agents pontants ( cisplatine , psoralène ) , et les radiomimétiques ( bléomycine ) pour ne citer qu' eux . Enfin des polluants tels que le Benzo [ a ] pyrène ( fumée de diesel , incinérateurs ) , les nitrosamines ( fumée de cigarette ) , peuvent aussi causer des modifications chimiques des bases . - Les modifications de l' ADN créées par des facteurs endogènes : Les espèces réactives de l' oxygène ( ERO ) font partie des principales sources endogènes de modification de l' ADN . Elles sont en grande partie générées par le métabolisme aérobie qui a lieu dans les mitochondries . Ces espèces sont nombreuses et comprennent entre autres le radical hydroxyle et le peroxyde d' hydrogène . Leur caractère électrophile les rend très réactives et elles peuvent notamment oxyder les bases de l' ADN . Ces oxydations conduisent à un nombre très important de bases modifiées , les plus étudiées étant la 8- oxoG , et les diols de thymines . La seconde source endogène de modification de l' ADN est la péroxydation lipidique . Cette réaction d' oxydation des lipides présents dans les membranes de la cellule conduit à la formation de produits de dégradation aldéhydiques ( 4-HNE , trans , trans- 2 , 4 -Decadienal ( DDE ) ) qui réagissent préférentiellement avec la guanine et forment des dérivés de type EthenoGuanine . - L' altération spontanée de base : Elle est due aux propriétés intrinsèques de la molécule d' ADN qui présente la particularité de se dépuriner de manière spontanée , conduisant ainsi à la formation de sites abasiques . A ce phénomène s' ajoute le fait que la cytosine possède la caractéristique de se désaminer spontanément , conduisant à la formation d' uracile . Toutefois , certaines cellules comme les lymphocytes possèdent des désasimases ( adénosine désaminase , cytosine désaminase ) qui jouent un rôle important dans les réarrangements des gènes des immunoglobulines La cellule a donc à faire face à une grande diversité de dommages de l' ADN : modifications de bases , pontages de bases , pontages de brins , cassures de chaînes , perte de base dont nous avons regroupé , en fonction de leur taille , les principaux représentants dans la Figure 1 . Nous allons , dans la partie qui suit , présenter les mécanismes que possèdent les cellules eucaryotes humaines afin de réparer les lésions de l' ADN ; nous verrons que le type et la taille du dommage joue un rôle important dans ce processus . Figure 1 : Figure présentant quelques lésions de l' ADN classées en fonction de leur taille . A . La réparation par excision de nucléotides ( REN ) 1 . Découverte et historique La réparation par excision de nucléotides est un système de réparation versatile qui est très largement répandu dans le monde vivant . En effet , il est aussi bien présent dans les mycoplasmes que dans les cellules eucaryotes , ce qui indique qu' il a été très conservé au cours de l' évolution . Les premières publications scientifiques décrivant ce système de réparation remontent à l' année 1964 , au cours de laquelle trois articles mirent en évidence ce mécanisme à la fois chez les mammifères mais aussi chez les bactéries . Quatre ans plus tard , la découverte de l' implication de la REN dans la prévention du processus de carcinogenèse fut possible grâce aux travaux de J.E. Cleaver menés sur les cellules de patients atteints de Xeroderma pigmentosum pigmentosum ( XP ) , une maladie génétique provoquant l' apparition précoce de cancers cutanés . Il fut notamment démontré que les cellules de patients XP étaient déficientes en réparation par excision de nucléotides . Les recherches sur la REN progressèrent alors formidablement grâce aux puissants outils que sont les cellules XP . Elles permirent d' identifier les gènes responsables du Xeroderma pigmentosum pigmentosum , et de remonter jusqu'aux protéines impliquées dans la réparation par excision de nucléotides . Les protéines ainsi découvertes portent le nom de XP suivi d' une lettre de l' alphabet correspondant au groupe de complémentation auquel elles appartiennent . Il restait alors à déterminer le mécanisme biochimique de la REN , la fonction des protéines impliquées et la manière dont elles s' assemblent . En 1986 , I. Mellon et P.C . Hanawalt démontrèrent que la REN peut être divisée en deux voies : la réparation couplée à la transcription ( RCT ) et la réparation globale du génome ( GGR ) . Il faudra attendre les travaux de R. Wood pour voir apparaître en 1988 le premier test in-vitro permettant de mesurer la réparation par excision de nucléotides , puis , en 1995 , la première reconstitution in-vitro de ce mécanisme avec des protéines purifiées . Toutes ces avancées ainsi que les plus récentes ont permis de mieux appréhender les bases génétiques et biochimiques de la réparation par excision de nucléotides . 2 . Le fonctionnement mécanistique de la réparation par excision de nucléotides La REN est un mécanisme que l' on peut décomposer simplement en cinq étapes : la reconnaissance du dommage , l' incision du brin d' ADN contenant le dommage , son excision , la re-synthèse du brin excisé , et enfin la ligation du brin néoformé . a ) La reconnaissance de la lésion Les types de dommages reconnus par la REN : La réparation par excision de nucléotides est un système de réparation très versatile car elle permet d' éliminer une grande variété de dommages tels que : Les lésions induites par les ultraviolets ( UV ) : les dimères cyclobutane de pyrimidine , les pp ( 6 - 4 ) . Les pontages intra-brin Les gros adduits de l' ADN comme par exemple ceux des hydrocarbures aromatiques polycycliques ( HAP ) . Cette versatilité réside dans le mode de reconnaissance du dommage , qui est basé sur la déformation de la structure de l' ADN générée par la lésion , et non sur la modification chimique de la base elle-même . Mécanismes de reconnaissance des lésions La REN est divisée en deux voies , la réparation couplée à la transcription et la réparation globale du génome . Ces deux voies ne diffèrent que par les processus de reconnaissance du dommage que nous allons présenter ici . La reconnaissance de dommages lors de la réparation couplée à la transcription ( RCT ) : La réparation couplée à la transcription est un système puissant car il permet à la cellule de réparer en priorité les gènes qui sont transcrits et donc importants pour la vie cellulaire . Lors de RCT , c' est le blocage de l' ARN polymérase au niveau du site lésé qui permet de recruter alors le complexe d' incision de la REN . Trois protéines semblent impliquées dans cette étape , ce sont : les protéines CSA et CSB , déficientes chez les patients atteints du syndrome de Cockayne , ainsi que la protéine XAB2 . Ces protéines permettent au complexe d' incision de la REN de venir se positionner au niveau du site lésé , notamment en permettant le retrait de l' ARN polymérase . Cependant le mécanisme d' action précis de ce processus n' a pas encore été clairement élucidé . La reconnaissance des dommages lors de la réparation globale du génome ( RGG ) : La réparation globale du génome , contrairement à la RCT , ne répare pas l' ADN en fonction de son niveau de transcription . Elle répare aussi bien les zones non codantes que codantes , ainsi que les brins transcrits et non transcrits . La RGG est donc très importante pour les cellules qui se divisent et se différencient , car elles ont besoin de transmettre à leur descendance un génome exempt de toute erreur . Lors de la RGG , plusieurs protéines sont impliquées dans la reconnaissance des dommages . Tout d' abord , le complexe protéique XPC / hHR 23B , qui est l' élément essentiel de ce processus . Il a la capacité de fixer sur l' ADN , avec une affinité d' autant plus importante si des dommages comme les dimères de pyrimidine , les photoproduits ( 6 - 4 ) , ou bien des adduits cisplatine ( CDDP ) sont présents . Cependant , ce complexe ne se limite pas à la reconnaissance du dommage dans le sens où il est aussi nécessaire au recrutement des protéines permettant de réaliser les étapes suivantes de la REN . Il a aussi été montré que l' étape de reconnaissance peut passer par le complexe DDB1 / DDB2 ( XPE ) qui a une affinité très forte pour les dimères de pyrimidine . Néanmoins , si XPC / hHR 23B n' est pas présent , le complexe DDB1 / DDB2 à lui seul ne permet pas à la REN d' avoir lieu . Deux hypothèses s' opposent quant au mécanisme impliqué . La première suggère que DDB1 / DDB2 fixe le dommage puis recrute alors directement le complexe XPC / hHR 23B . La seconde , quant à elle , confère à DDB1 / DDB2 un rôle dans le remaniement de la chromatine permettant ainsi à XPC / hHR 23B d' avoir accès au site lésé . Pour finir , la protéine XPA a longtemps été considérée comme la protéine présente dans les toutes premières étapes de reconnaissance des dommages . Le fait que cette protéine présente une certaine affinité pour l' ADN endommagé , ainsi que la sévérité des cas de Xeroderma pigmentosum pigmentosum qu' elle engendre lorsqu' elle est mutée , en faisait une candidate idéale . Aujourd'hui son rôle semble plus clair , elle n' interviendrait pas dans l' étape précoce de reconnaissance , mais jouerait plutôt un rôle dans la stabilisation du complexe d' incision , et ce , de concert avec la protéine RPA . Cette stabilisation passerait par une reconnaissance du dommage , XPA / RPA aurait une fonction de vérificateur de la présence effective d' une lésion afin de ne pas réaliser d' incision dans un brin d' ADN non lésé ( Figure 2 ) . Figure 2 : Schéma représentant les différentes voies de reconnaissance du dommage au cours de la réparation par excision de nucléotides . b ) L' étape d' incision et d' excision Une fois que le dommage est reconnu , le complexe d' incision est alors formé afin d' éliminer la lésion . Le facteur TFIIH est tout d' abord recruté , il est composé notamment de deux hélicases XPB et XPD qui , en présence d' ATP , vont permettre de dérouler la double hélice d' ADN . Cette ouverture de la double hélice permet le recrutement des protéines nécessaires à la suite du processus de réparation . Il est intéressant de noter que TFIIH est aussi nécessaire lors de la transcription , et que son rôle dans la REN doit être proche de celui qu' il joue lors de l' initiation de la transcription . La protéine XPA rejoint alors le complexe . La suite du processus d' incision se déroule avec le recrutement de la protéine RPA qui se fixe à XPA , et de l' endonucléase XPG qui se positionne en 3 ' de la lésion . XPC et hHR 23B quittent alors le complexe de réparation . Le duplex ERCC1 / XPF , qui tout comme XPG a une activité endonucléase , se positionne en 5 ' de la lésion . La double incision en 5 ' et 3 ' du dommage a ensuite lieu ; cette étape est dépendante de Mg 2 + , cation nécessaire à l' activité endonucléase de XPG . Le brin d' ADN contenant le dommage , d' une taille d' environ trente nucléotides , est alors excisé ( Figure 3 ) . c ) L' étape de resynthèse et de ligation Le complexe de resynthèse est composé de la polymérase réplicative & 206;& 181; ou & 206;& 180; , du facteur de processivité PCNA , et de RFC . Le facteur RFC permet de charger PCNA sur l' ADN qui va permettre à la polymérase de resynthétiser l' ADN excisé en prenant comme modèle le brin complémentaire . Pour finir , la ligase I vient ligaturer la double hélice d' ADN ( Figure 2 ) . Figure 3 : Schéma présentant les différentes étapes lors de la réparation par excision de nucléotides . 3 . Voie de signalisation et régulation de la REN Nous allons aborder maintenant la manière dont la cellule régule le système de réparation par excision de nucléotides et présenter les différents mécanismes que possède la cellule pour contrôler ce formidable outil de réparation . a ) ATR : senseur des dommages Au cours de sa vie , la cellule fait face à un nombre variable de dommages . En effet , les dommages que subit son ADN sont en grande partie liés à des événements exogènes imprévisibles comme l' exposition au rayonnement solaire , la pollution . La cellule a donc besoin de senseurs capables d' activer des effecteurs lui permettant d' adapter son niveau de réparation . La protéine ATR est un des principaux senseurs qui permettent de réguler la REN , c' est une kinase qui appartient à la famille des PIKK . Cette protéine est présente dans le noyau sous forme de dimère avec ATRIP , et peut se fixer sur les fourches de réplication bloquées , ainsi que sur les dommages UV induits . Dans l' un ou l' autre de ces cas , ATR s' autophosphoryle , et déclenche alors une cascade de signalisation par phosphorylations successives qui aboutissent à l' activation de différents effecteurs tels que : p 53 qui est un des principaux effecteurs agissant sur la REN et le cycle cellulaire . BRCA1 qui est impliqué dans la recombinaison homologue . Chk 1 qui va permettre de bloquer le cycle cellulaire . Tous ces effecteurs sont essentiels quant à l' adaptation de la réponse cellulaire aux dommages de l' ADN . Comme nous allons le voir , la protéine p 53 est impliquée fortement et à plusieurs niveaux dans la régulation de la REN . Il est à noter qu' une voie de signalisation très similaire existe , elle a pour senseur ATM qui est aussi une protéine de la famille des PIKK . Cette voie est décrite comme pouvant être activée par la présence de cassures dans l' ADN , elle a aussi p 53 comme effecteur central . Elle pourrait donc par l' intermédiaire de p 53 réguler aussi la REN . b ) p 53 : un effecteur important régulant la REN La protéine p 53 , aussi appelée protéine gardienne du génome , est impliquée dans beaucoup de processus cellulaires , comme notamment l' apoptose , la régulation du cycle cellulaire , mais aussi la réparation de l' ADN . Elle est très fortement impliquée dans la régulation de la réparation par excision de nucléotides et ce à deux niveaux : Premièrement au niveau transcriptionnel : une fois activée par phosphorylation ( par exemple par la voie de signalisation ATR ) , p 53 peut directement induire la transcription des gènes codant pour les deux protéines de reconnaissance de dommage de la RGG , à savoir XPC et DDB2 . Cette induction est rendue possible grâce au rôle de facteur de transcription que joue alors p 53 en se fixant à son élément de réponse qui est présent au niveau des promoteurs respectifs des gènes XPC et DDB2 . Le deuxième niveau de régulation , controversé , se ferait par une interaction directe de p 53 avec XPB et XPD du complexe TFIIH . Cependant les conséquences de cette interaction ne sont pas claires et pourraient jouer un rôle plus important dans la régulation de l' apoptose que dans celle de la REN . c ) L' ubiquitination des protéines de reconnaissance de la REN L' ubiquitination est un mécanisme impliqué dans la régulation et la dégradation des protéines . L' ubiquitination consiste en l' ajout d' un peptide d' ubiquitine sur une protéine ; le degré d' ubiquitination peut varier et conduire à des conséquences diverses . La polyubiquitination a comme principale conséquence la dégradation de la protéine par le complexe du protéasome , la monoubiquitination quant à elle semblerait moduler l' activité des protéines , leur localisation , ainsi que leurs interactions . - L' ubiquitination de DDB2 Il a été montré que , bien qu' étant induite après une irradiation UV , DDB2 est rapidement dégradée . Or cette dégradation est empêchée par des inhibiteurs du protéasome , confortant ainsi l' idée que cette régulation passe par une ubiquitination de DDB2 . Une hypothèse pour expliquer cette dégradation serait l' élimination de DDB2 permettant ainsi l' accès de la protéine XPC au dommage . Cette régulation par ubiquitination rajoute un niveau de complexité à la régulation de DDB2 qui est aussi dépendante de p 53 . - L' ubiquitination de XPC La protéine XPC est elle aussi régulée par ubiquitination car , tout comme DDB2 , sa dégradation est stoppée par les inhibiteurs du protéasome . La protéine hHR 23B régulerait cette dégradation en masquant le site d' ubiquitination d' XPC lorsque ces deux protéines sont sous forme de complexe . d ) Conclusion La régulation de la REN est donc un phénomène très complexe ( Figure 4 ) qui permet à la cellule d' ajuster finement l' activité de la réparation par excision de nucléotides et ainsi s' adapter à son environnement . Elle peut avoir lieu à différents niveaux : du senseur à l' effecteur en passant par les protéines de reconnaissance des dommages . A cela s' ajoute un second niveau de régulation par ubiquitination . Figure 4 : Figure représentant le système de régulation de la REN . Le seneur de dommage ATR active l' effecteur p 53 , qui régule la transcription des gènes XPC et DDB2 . Le protéasome dégrade les protéines XPC et DDB2 dans le cas où elles sont ubiquitinylées La réparation par excision de base ( REB ) 1 . Découverte et historique Tout comme la réparation par excision de nucléotides , la réparation par excision de base est très largement représentée chez les êtres vivants . Cependant sa découverte a été beaucoup plus tardive , et ceci peut s' expliquer par plusieurs facteurs . Premièrement , aucune maladie génétique liée à la REB n' a été découverte , l' attention des chercheurs n' a donc pas pu être focalisée par l' existence d' un phénotype particulier . Deuxièmement , son observation in vitro a longtemps été masquée et/ou confondue avec des activités de dégradation de l' ADN de type nucléase . En effet , la première découverte d' une activité enzymatique impliquée dans la REB remonte à 1972 , date à laquelle est décrite chez E.coli une activité endonucléase spécifique des sites dépurinés . Les auteurs de l' article émettent l' hypothèse que cette enzyme permet de réparer les sites dépurinés . Toujours chez E.coli , T. Lindahl mettra en évidence en 1974 une activité glycosylase capable d' éliminer les uraciles de l' ADN . En 1979 , c' est T. Lindahl encore qui posera les bases de la REB , à savoir : une glycosylase coupe la base lésée formant ainsi un site abasique , puis une endonucléase coupe l' hélice d' ADN permettant la resynthèse de la partie lésée . Un grand nombre de glycosylases seront alors découvertes et étudiées , aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes . La compréhension mécanistique de la REB sera approfondie quand , en 1994 , D.F . Bogenhagen démontre chez Xenopus laevis que deux voies de resynthèse du brin réparé existent . Une non dépendante de PCNA où la taille du brin synthétisé est de 1 à 2 nucléotides ( voie de resynthèse courte ) , et l' autre dépendante de PCNA présentant une resynthèse de cinq à sept nucléotides ( voie de resynthèse longue ) . Un an plus tard , E . Dogliotti et A. Abbondandolo mettront en évidence que ces deux voies de resynthèse existent aussi dans les cellules des mammifères . A l' heure actuelle , des questions restent encore en suspens : & 226;& 151;& 143; Comment se fait la sélection entre la voie de resynthèse longue et courte ? & 226;& 151;& 143; Existe -t-il une réparation par excision de base couplée à la transcription ? Nous le verrons un peu plus loin dans ce chapitre , des théories s' opposent concernant l' une ou l' autre de ces deux questions . 2 . Le mécanisme de la réparation par excision de base a ) La reconnaissance de la base lésée Les types de dommages reconnus par la REB Contrairement à la réparation par excision de nucléotides , la REB répare les petits dommages de l' ADN , à savoir les modifications de bases . Il existe plusieurs facteurs pouvant modifier la chimie des bases : & 226;& 151;& 143; La désamination spontanée de la cytosine qui conduit à la formation de l' uracile . & 226;& 151;& 143; Les espèces réactives de l' oxygène qui peuvent , en réagissant avec l' ADN , conduire à la formation de toute une famille de bases oxydées dont la plus étudiée est la 8- oxoG . & 226;& 151;& 143; Les aldéhydes issus de la peroxydation lipidique qui peuvent induire par l' intermédiaire du 4 -Hydroxynonenal ( HNE ) des adduits exocycliques . & 226;& 151;& 143; Les agents chimiques qui peuvent alkyler les bases en ajoutant par exemple un groupement méthyle . Comme nous le constatons , l' éventail des dommages auxquels fait face la réparation par excision de base est donc large et très varié et suppose une stratégie de reconnaissance adaptée . Le mécanisme de reconnaissance de la base modifiée et son excision Au cours de la réparation par excision de base , c' est une ADN N-Glycosylase qui réalise l' étape de reconnaissance de la base modifiée et procède alors à son excision . Après sa fixation sur la base lésée , l' ADN N-Glycosylase N-Glycosylase coupe la lésion N-glycosidique qui relie la base au sucre , il en résulte alors un site abasique . Face au nombre important de bases modifiées , la cellule a acquis un nombre important d' ADN N-Glycosylases N-Glycosylases , chacune plus ou moins spécifique d' un dommage . Cette stratégie , à l' opposée de celle de la réparation par excision de nucléotides , permet d' avoir une reconnaissance très fine et précise de modifications chimiques parfois minimes . Cette reconnaissance passe par la conformation spatiale bien particulière des ADN N-Glycosylases N-Glycosylases . En effet , la plupart d' entre elles partagent une conformation tridimensionnelle très proche bien qu' ayant des séquences peptidiques totalement différentes . Elles ont aussi en commun un domaine de fixation à l' ADN de type helice-boucle-helice ( HbH ) . Ces similarités ont permis de les regrouper dans une superfamille d' ADN N-Glycosylase N-Glycosylase . Le Tableau 1 ci-dessous présente quelques ADN N-Glycosylases N-Glycosylases humaines ainsi que les bases modifiées qu' elles peuvent reconnaître et exciser . Tableau 1 : Tableau regroupant différentes ADN N-Glycosylases N-Glycosylases humaines et leurs activités . Il est à noter que certaines glycosylases présentent aussi une activité AP lyase , en plus de leur activité N-Glycosylase , qui permet d' inciser l' ADN après formation du site abasique . Nous allons le voir , cette activité AP lyase a une importance sur le déroulement de la suite du mécanisme de réparation . b ) L' incision du brin d' ADN Une fois que le site abasique est formé par l' ADN N-Glycosylase N-Glycosylase , une incision dans le brin d' ADN doit avoir lieu afin de permettre la resynthèse de la base éliminée . Cette incision peut être réalisée selon deux mécanismes distincts . Incision réalisée par les AP-Endonucléases : Cette incision peut être réalisée par une famille de protéines appelées AP-Endonucléases / Exonucléases . Deux d' entre elles ont été identifiées chez l' homme pour le moment , il s' agit de APEX1 et APEX2 . Ces protéines ont la capacité de reconnaître les sites abasiques et d' hydrolyser la liaison phosphodiester qui se trouve en 5 ' provoquant ainsi l' ouverture de la double hélice ; elles présentent aussi de faibles activités exonucléases . L' activité de APEX1 est dépendante en cations divalents notamment en Mg 2 + , le magnésium affecte à la fois l' interaction avec l' ADN et le clivage de la liaison phosphodiester . Il est intéressant de noter que APEX1 est aussi impliquée dans d' autres mécanismes . Sa région N-terminale permet notamment d' activer , par réduction , plusieurs facteurs de transcription : AP- 1 , NF-& 239;& 129;& 171;B , p 53 , Myb , ATF , CREB , impliqués dans de nombreux mécanismes cellulaires . Cette activité réductrice de APEX1 est modulée par le niveau rédox cellulaire . Lors de stress oxydant , APEX1 est rapidement oxydé et n' est plus capable , par exemple , d' activer AP- 1 ; la régénération de l' activité rédox de la protéine APEX1 est alors assurée par la thioredoxine . Les ADN N-Glycosylases N-Glycosylases AP lyase : L' étape d' incision peut aussi être réalisée par les ADN N-Glycosylases N-Glycosylases ayant une activité AP lyase . Grâce à cette activité AP lyase , elles sont capables d' hydrolyser la liaison phosphodiester qui est en 3 ' d' un site abasique . Dans le cas où une glycosylase bifonctionnelle excise une base et crée un site abasique , elle générera alors aussi une coupure en 3 ' du site abasique . Cette double activité permet de diminuer le temps de réparation , puisque dans ce cas précis le recrutement d' une endonucléase n' est pas nécessaire . Lors de l' incision du brin d' ADN au niveau du site abasique par une AP lyase , la liaison phosphodiester sur laquelle était fixée la base modifiée doit être éliminée afin de permettre la resynthèse d' ADN . Une phosphodiestérase réalise cette hydrolyse , permettant la formation d' un 3 ' OH nécessaire pour l' élongation du brin d' ADN neosynthétisé neosynthétisé . c ) Resynthèse de la zone excisée Deux voies de resynthèse sont possibles , et pour chacune d' entre elles le nombre de nucléotides incorporés diffère : La voie de resynthèse courte : Durant cette voie de resynthèse , un à deux nucléotides sont incorporés par la polymérase & 206;& 178; associée à XRCC1 . La voie de resynthèse longue : Contrairement à la voie courte , lors de la voie de resynthèse longue , un nombre plus important de nucléotides est incorporé , environ cinq à sept . Cette étape est réalisée par les mêmes polymérases que celles impliquées dans la resynthèse lors de REN , à savoir : les polymérases & 206;& 181; ou & 206;& 180; associées au facteur de processivité PCNA . Les polymérases & 206;& 181; et & 206;& 180; n' ayant pas d' activité dRpase , les nucléotides qu' elles polymérisent provoquent une zone de recouvrement où l' ancien brin d' ADN n' est plus hybridé à son complémentaire . Une Flap endonucléase ( FEN1 ) va alors venir le couper afin de permettre à l' étape de ligation d' avoir lieu . Ce mécanisme de sélection entre l' une ou l' autre de ces deux voies n' a pas encore été élucidée . Certains résultats tendent à montrer que cette sélection dépendrait de la glycosylase qui a réalisé l' excision , d' autres qu' elle serait guidée par la capacité à éliminer le résidu dRp . L' hypothèse est que , si le résidu dRP est hydrolysé rapidement , alors la voie de resynthèse courte est favorisée et inversement . d ) L' étape de ligation Cette étape finale de la REB fait intervenir différents acteurs en fonction de la voie de resynthèse qui a été prise . Dans le cas de la voie courte , c' est le complexe ligase III / XRCC1 qui referme la double hélice d' ADN , lors de la voie longue c' est le complexe ligase I / XRCC1 . Il est à noter que l' étape de ligation de la voie longue partage la même ligase que celle utilisée par la REN . Ci-après est présenté un schéma récapitulatif de toutes les étapes de la réparation par excision de base ( Figure 5 ) . Figure 5 : Schéma représentant le déroulement séquentiel des différentes étapes de la réparation d' une base lésée ( noire ) par la REB , ainsi que les différentes voies de resynthèse possibles . 3 . La réparation par excision de base couplée à la transcription De nombreux travaux se sont attachés à l' étude de la réparation par excision de base couplée à la transcription . Cependant , aucune démonstration génétique ou biochimique n' a pu mettre en avant un rôle direct de la REB . De plus , les bases modifiées comme la 8- oxoG et les diols de thymines ne bloquent que très faiblement l' ARN polymérase ( 50 % ) , ce qui pourrait rendre plus difficile le recrutement des protéines de réparation . Toutefois il faut rester très prudent quant à cette éventuelle implication de la REB dans la réparation couplée à la transcription , des éclaircissements sur ce mécanisme étant nécessaires . 4 . La régulation de la réparation par excision de base Contrairement à la réparation par excision de nucléotides , très peu de données sont disponibles concernant la régulation de la réparation par excision de base . Toutefois , dans l' état actuel des connaissances , la protéine p 53 semble ici aussi jouer un rôle très important , et ce à deux niveaux : & 226;& 151;& 143; De manière indirecte , en régulant le niveau d' expression du gène codant pour la polymérase & 206;& 178;. & 226;& 151;& 143; De manière directe , en interagissant et en stimulant différentes protéines impliquées dans la REB , notamment APEX1 et la polymérase & 206;& 178;. L' implication de p 53 dans la régulation de la réparation par excision de base souligne une nouvelle fois son rôle dans le maintien de l' intégrité du génome . La Poly ( ADP-ribose ) polymérase ( PARP ) est une protéine décrite comme intervenant dans la régulation de la REB . La PARP est capable de polymériser de l' ADP-ribose sur d' autres protéines , mais aussi et principalement sur elle-même en utilisant du NAD + comme source d' ADP-ribose . Cette polymérisation lui permet de recruter des protéines , notamment lorsque la PARP est activée par la présence de cassures double , simple brin , ou de résidu dRp , ce dernier par exemple étant produit lors de la REB . La PARP semble réguler la REB en agissant sur le recrutement spécifique de la protéine XRCC1 , de la polymérase & 206;& 178; , et de la ligase 3 avec lesquelles elle peut interagir . Ce recrutement est modulé par l' état d' activation de la PARP qui dépendrait dans ce cas précis de la présence de résidus dRp , mais aussi de la concentration cellulaire en NAD + . Enfin , une voie de régulation concernant la glycosylase UDG a aussi été décrite . La quantité d' UDG semble régulée en fonction du cycle cellulaire , sa quantité doublant entre la phase G1 et la phase S. Cette régulation permettrait à la cellule , en augmentant sa quantité de glycosylase au cours de la division cellulaire , d' améliorer ses capacités de réparation , et ainsi de réduire le nombre de dommages transmis à sa descendance . 5 . Comparaison entre la REN et la REB Le Tableau 2 présenté ci-dessous permet d' avoir une vue d' ensemble des carractéristiques principales de la de la REN et de la REB , et ainsi d' apprécier leurs similitudes et différences . Tableau 2 : Tableau de comparaison entre la REN et la voie de resynthèse courte et longue de la REB . C . Les autres systèmes de réparation Nous venons de présenter les systèmes de réparation par excision de nucléotides et de réparation par excision de base , cependant d' autres mécanismes de réparation tout aussi importants existent et prennent en charge d' autres types de dommages . Nous allons aborder dans cette partie quelques-uns de ces mécanismes . 1 . Les systèmes de réparation des cassures de l' ADN Aux cours de la vie cellulaire , des cassures de la double hélice d' ADN peuvent survenir . Plusieurs facteurs sont à l' origine de ces cassures , notamment les espèces réactives de l' oxygène , mais aussi le rayonnement ionisant . Ces cassures de la chaîne d' ADN peuvent engendrer des instabilités génomiques telles que des remaniements chromosomiques . Actuellement , nous connaissons deux systèmes de réparation permettant de corriger ces dommages . a ) La réparation par recombinaison non homologue ( RNH ) La réparation par recombinaison non homologue est la principale voie de réparation des cassures double brin chez les eucaryotes . Elle permet de rejoindre deux extrémités d' ADN même si ces dernières n' ont pas ou très peu d' homologie de séquences . Ce mécanisme est initié par le dimère Ku 80 / Ku 70 qui a la capacité de fixer les extrémités d' ADN . Son premier rôle serait de protéger les extrémités afin d' éviter leur dégradation et de permettre leur bon positionnement . Ku 80 et Ku 70 recrutent la protéine DNA-PK qui s' active alors et permet l' arrivée d' autres facteurs essentiels pour la suite du processus , à savoir Rad 50 , Mre 11 et Xrs 2 . Ces protéines sont impliquées dans la préparation des extrémités de l' ADN , ajout , suppression de nucléotides , et dans le maintien de l' organisation spatiale des deux brins d' ADN . La ligase IV en dimère avec XRCC4 vient alors ressouder les deux brins d' ADN ( Figure 6 ) . Figure 6 : Schéma présentant les différentes étapes lors de la réparation non homologue de cassures double brin de l' ADN Il est important de souligner que le fonctionnement même de ce système de réparation peut générer des mutations ; en effet , comme aucune complémentarité des brins n' est nécessaire pour que la RNH ait lieu , deux brins non complémentaires peuvent être rejoints . De plus , avant que les extrémités d' ADN ne soient prises en charge par la ligase , des nucléotides peuvent être ajoutés ou retirés , ce qui accroit le risque mutagène de la RNH . b ) La réparation par recombinaison homologue ( RH ) La réparation par recombinaison homologue est un mécanisme beaucoup plus complexe que celui de la recombinaison non homologue . Contrairement à cette dernière , il utilise la complémentarité des brins d' ADN afin de les rejoindre . Par conséquent , aucune information génétique n' est théoriquement perdue ou modifiée . Cependant , il semblerait que ce mode de réparation des cassures double brin soit moins utilisé par la cellule que la RNH , et serait restreint aux phases S et G2 du cycle cellulaire où les recombinaisons entre chromatides soeurs peuvent avoir lieu . Nous ne rentrerons pas dans les détails mécanistiques de ce mode de réparation dont une partie de son fonctionnement n' a pas été élucidée . 2 . Les polymérases translésionelles Un dommage est dangereux pour la cellule s' il modifie les données génétiques , mais aussi s' il bloque la réplication , ce qui peut provoquer la formation de chromosomes tronqués et conduire à un processus de cancérisation . A l' entrée du cycle cellulaire , il arrive que certains dommages pouvant bloquer les polymérases ( réplicationnelles DCP , pp ( 6 - 4 ) ) n' aient pas été réparés , soit parce qu' ils sont passés aux travers des systèmes de réparation , soit parce que leur formation est récente . Dans ce cas de figure , des polymérases translésionelles sont mises en jeu . Ces enzymes sont capables de polymériser des nucléotides bien qu' un dommage soit présent sur le brin matrice . Actuellement , cinq de ces polymérases ont été identifiées , ce sont les polymérases & 206;& 186; , & 206;& 188; , & 206;& 184; , & 206;& 185; , et & 206;& 183;. Lorsque l' une des deux polymérases réplicationnelles & 206;& 181; ou & 206;& 180; se trouve bloquée au niveau d' un dommage , une des polymérases translésionelles prend alors le relais afin de passer cet obstacle . Par la suite , la polymérase translésionelle se retire de l' ADN et une des polymérases réplicationnelles reprend alors la polymérisation ( Figure 7 ) . Figure 7 : Les différentes étapes lors de la polymérisation translésionelle de DCP ( point rouge ) Certaines des polymérases translésionelles ne conduisent pas à des mutations . On peut citer par exemple la polymérase & 206;& 183; qui réalise une synthèse translésionelle non mutagène des dimères de thymines , la polymérase & 206;& 186; est aussi capable de passer des dommages tels que la 8- oxoG , les diols de thymines sans introduire d' erreur . Cependant , certaines polymérases comme la & 206;& 184; ne permettent pas de réaliser une synthèse translésionelle sans introduire de modification dans la séquence nucléotidique . Ceci souligne le fait que , pour la cellule , il est plus important d' éviter un blocage de la fourche de réplication que d' introduire des mutations dans son génome . Nous allons le voir maintenant , la cellule est dotée de systèmes capables de réparer ces mésappariements . 3 . La réparation des mésappariements et des insertions / délétions Les mésappariements de bases sont des dommages qui se produisent très fréquemment durant la vie cellulaire . Par exemple , pendant la réplication , les polymérases peuvent introduire des erreurs de deux manières : en ne mettant pas le nucléotide correct en face de son complémentaire , ou en faisant des insertions / délétions de nucléotides . La réparation des mésappariements et des insertions / délétions fait intervenir plusieurs dimères de protéines qui ont chacun leurs spécificités . Par exemple , MutS& 206;& 177; dimère formé par hMSH 2 / hMSH 6 , reconnaît les mésappariements de bases ainsi que les insertions et délétions de un à huit nucléotides . MutS& 206;& 178; , dimère formé par hMSH 2 / hMSH 3 , reconnaît des boucles d' insertion / délétion plus grandes , mais ne reconnait que très faiblement celle d' un seul nucléotide . MutS& 206;& 177; et MutS& 206;& 178; jouent un véritable rôle de senseur et peuvent s' activer de manière ATP dépendante lorsqu' ils rencontrent un mésappariement ou une insertion délétion . Cette activation permet de recruter alors de manière ATP dépendante MutL& 206;& 177; dimère formé par hMLH 1 / hPMS 2 , ce qui conduit à l' incision de l' ADN . Le complexe PCNA , RFC , polymérase & 206;& 180; vient ensuite synthétiser l' ADN de la zone réparée . Plusieurs questions restent en suspend quant à la réparation des mésappariements : Quel est l' homologue humain de MutH , la protéine réalisant l' excision chez E.coli ? Comment , chez les eucaryotes , est -ce que ce système de réparation reconnaît et discrimine le brin à corriger ? 4 . Les alkyltransférases Nous avons brièvement abordé lors de la partie consacrée à la réparation par excision de base les lésions provoquées par les agents alkylants . Ces dommages sont la conséquence de l' ajout d' un groupement chimique sur une des quatre bases de l' ADN , ce qui peut avoir comme conséquence de provoquer des mutations lors de la réplication . Des sources diverses d' agents alkylants existent , comme le chlorure de méthyle , produit par exemple lors de la combustion de la biomasse , mais aussi les nitrosamines présentes dans la fumée de cigarette , ou encore le diméthyle sulfate ( DMS ) utilisé par l' industrie chimique et pharmaceutique . Nous sommes donc amenés à être exposés fréquemment à ce type de dommage . a ) La O 6 -MéthylGuanine DNA MéthyleTransférase ( O6-MGMT ) La O 6 -MethylGuanine , alkylation de la guanine par un groupement méthyle est un des rares dommages qui est spécifiquement pris en charge par un système de réparation dédié . Ce système de réparation est composé d' une seule enzyme , la O6-MGMT , qui a la capacité de retirer le groupement méthyle de la guanine . Lors de la réaction de réparation , la cystéine de la O6-MGMT joue le rôle d' accepteur de méthyle . L' enzyme sous forme méthylée n' est plus fonctionnelle et sera alors dégradée , d' où son appellation « d' enzyme suicide » ( Figure 8 ) . Il est intéressant de noter que l' O6-MGMT procède à une réparation directe de la base endommagée et non à son élimination et son remplacement comme dans la REB ou la REN . Figure 8 : Les différentes étape de la réparation de l' O 6 -MethylGuanine par la O6-MGMT . b ) ABH1 , 2 et 3 Les gènes ABH1 , ABH2 et ABH3 codent pour des methyle-transférases homologues de AlkB chez E.coli . ABH1 , ABH2 , et ABH3 peuvent retirer le groupement méthyle de la 1- méthyladénine et de la 3- méthylcytosine par une réaction oxydative dépendante en Fe 2 + et 2- oxoglutarate Figure 9 . Figure 9 : Réparation de la 1- méthyladénine et de la 3- méthylcytosine par ABH1 , 2 ou 3 . ABH3 semble pouvoir réparer les bases méthylées présentes dans l' ARN comme la 1- méthyladénine et la 3- méthylcytosine . Mais très peu de recherches se sont focalisées sur la réparation de l' ARN . Cependant , il a été montré que la présence de groupements méthyles sur les bases des ARN pouvait bloquer la traduction . D . Complémentarités et interactions des systèmes de réparation Comme nous venons de le voir , chaque système de réparation est spécifique d' un type ou d' une famille de dommages , ce qui les rend complémentaires les uns des autres . Si la REN est spécialisée dans les dommages qui induisent une déformation dans la double hélice d' ADN , la REB au contraire répare essentiellement les petites modifications de bases . La RH et la RNH quant à elles sont dédiées à la réparation des cassures double brin , et la O6-MGMT à la réparation des bases alkylées . Cependant , notre connaissance évolue , et de plus en plus de résultats montrent que des interactions entre les différents mécanismes de réparation ont lieu . A . Sancar à démontré in vitro que les protéines de la réparation par excision de nucléotides sont capables d' exciser faiblement des dommages oxydatifs , émettant l' hypothèse que la REN pourrait jouer , dans certains cas , un rôle de complément à la REB . Toujours dans ce même sens , les protéines XPA et XPG sembleraient favoriser les activités de la REB suggérant , là aussi , des interactions entre ces deux systèmes de réparation par l' intermédiare de certaines protéines . De leur côté , des protéines liées à la réparation des mésappariements auraient aussi des implications avec d' autres systèmes de réparation . Les protéines hMLH 1 et hMSH 2 semblent jouer un rôle dans la RCT des dommages UVC induits , et que MutS& 206;& 177; serait capable de reconnaître la 8- oxo-Guanine . Compte tenu de ces résultats récents , les systèmes de réparation apparaissent donc plus complexes que la vision segmentée que l' on pouvait en avoir . Les complémentarités et les interactions qui les régissent demandent donc de les appréhender de façon plus globale . E . Régulation par translocation nucléaire des protéines de réparation Beaucoup de recherches portent sur le déclenchement des voies de signalisation agissant sur la réparation de l' ADN , mais peu d' entre elles traitent de la régulation des systèmes de réparation , à savoir la modulation positive et négative de ces activités . Nous avons vu que certains gènes de réparation peuvent être induits et que leur produit peut être dégradé s' il est ubiquitinylé ; ce mécanisme constitue en soi une régulation . Cependant , certaines recherches ont montré qu' une régulation pouvait aussi avoir lieu par modulation de la translocation nucléaire des protéines de réparation , et ce pour différents systèmes de réparation . Une translocation nucléaire directement dépendante de la présence de dommages a été mise en évidence pour des protéines impliquées dans : La REN : DDB1 / DDB2 La RCT : CSA Le mécanisme de réparation des mésappariements : MSH2 , MSH6 Les effecteurs entrant en jeu afin de provoquer cette translocation ne sont pas toujours connus . Cependant , il a été montré que la protéine XPA peut être transloquée vers le noyau de manière ATR dépendante , dans ce cas précis la translocation pourrait être médiée par un effecteur de ATR . Les différentes protéines dont nous venons de parler possèdent dans leur séquence un signal de localisation nucléaire ( SLN ) , mais n' ont , pour le moment , pas été décrites comme possédant un signal d' export nucléaire ( SEN ) . Une fois la réparation des dommages effectuée , la cellule doit à nouveau retrouver un niveau de réparation basal . Leur dégradation par le protéasome suite à leur ubiquitination pourrait donc avoir lieu , comme cela a été décrit par exemple pour DDB2 . Toutefois la protéine APEX1 impliquée dans la REB possède à la fois un SLN et un SEN , suggérant qu' une régulation par import-export pourrait aussi avoir lieu . La translocation des enzymes de réparation apparaît donc comme une voie de régulation potentiellement importante des systèmes de réparation , dont l' implication concrète reste à déterminer . F . Dommages de l' ADN et cycle cellulaire Le cycle cellulaire est un processus très important de la vie cellulaire , durant lequel l' intégralité du génome va être dupliqué . La cellule doit donc éviter qu' il ait des dommages avant de débuter le cycle et que des dommages ne se forment pendant le cycle . Pour cela deux mécanismes coopèrent , le premier est basé sur un réseau de protéines capables de bloquer le cycle si des dommages sont présents afin de permettre leur réparation . Ce réseau comprend deux protéines senseurs de dommages ATR et ATM qui déclenchent une cascade de signalisation , passant respectivement par Chk 1 et Chk 2 , capables de bloquer le cycle cellulaire en G2 / M et G1 / S . Mais ATM et ATR ont aussi comme effecteur p 53 ; ce dernier , par l' intermédiaire de p 21 , est capable de bloquer le cycle en phase G1 / S et en phase G2 . Enfin la protéine BRCA1 peut être activée par ATM et arrêter le cycle en phase S . Le deuxième mécanisme permettant d' éviter l' apparition de dommages durant le cycle cellulaire est basé sur une régulation des protéines de réparation en fonction des phases du cycle . Ce mécanisme permet ainsi à la cellule d' augmenter ses capacités de réparation de l' ADN de manière à les adapter aux besoins du cycle cellulaire . A l' heure actuelle , seuls trois systèmes de réparation semblent présenter ce type de régulation . Pour la REB , il a été montré que la quantité en UNG double lors de la phase S , et que la quantité de transcrit APEX1 est également mulipliée par quatre au moment de la phase S. La réparation des mésapariements de son côté voit la quantité des protéines hMLH 1 et hPMS 2 augmenter entre la phase G1 et S. Enfin une régulation importante des protéines impliquées dans la réparation par recombinaison homologue est non homologue a été démontrée . Les activités des protéines Rad 50 et DNA-PK sont plus importantes lors de la phase G1 / S , alors que l' activité des protéines Rad 52 , Rad 51 et Ku 80 augmente lors des phases G2 / M. Pour le moment , il semblerait donc que la réparation des cassures soit le mécanisme de réparation le plus régulé au cours du cycle cellulaire . Les cassures de l' ADN pouvant survenir lors du cycle , et avoir des conséquences graves , son importance au cours de ce processus est donc capitale . Un schéma intégrant ces deux mécanismes impliqués lors du cycle cellulaire est présenté sur la Figure 10 . Figure 10 : Schéma présentant les différents mécanismes d' arrêt du cycle cellulaire induits par la présence de dommages , ainsi que la régulation en fonction du cycle cellulaire de protéines de réparation impliquées dans la REB , la RMA , la RNH et la RH . II . Les maladies impliquant les systèmes de réparation Les systèmes de réparation de l' ADN , nous venons de le voir , veillent au maintien de l' intégrité du génome . Nous allons aborder dans cette partie les conséquences que peuvent avoir des défauts dans leur fonctionnement . A . Implication des systèmes de réparation dans le processus de carcinogenèse et de résistance aux traitements de chimiothérapie et radiothérapie 1 . Implication de la réparation de l' ADN dans le processus de carcinogenèse Chez tous les organismes pluricellulaires adultes , il existe un équilibre entre le nombre de cellules qui se divisent et le nombre de cellules qui meurent . Cette régulation délicate de la prolifération cellulaire permet le maintien de l' organisation structurelle et fonctionnelle des organes et par conséquent de conserver l' intégrité de l' individu . La transformation cellulaire est un phénomène qui tend à détruire cet équilibre conduisant à l' immortalisation d' une cellule et à sa multiplication clonale par des divisions non régulées . Ce processus complexe fait intervenir l' activation de proto-oncogènes et l' inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs . Les proto-oncogènes codent pour des protéines impliquées dans différents processus cellulaires favorisant par exemple la prolifération cellulaire , le cycle cellulaire , mais aussi empêchant la cellule de mourir par apoptose . Les gènes suppresseurs de tumeurs , de leur côté , possèdent des activités opposées , telles que : inhiber la prolifération cellulaire , bloquer le cycle cellulaire , induire l' apoptose , et favoriser la réparation de l' ADN . Dans la plupart des cas , les événements conduisant aux changements d' activité des protéines codées par des proto-oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs sont liés à des modifications du code génétique , ceci pouvant se produire de différentes façons . Premièrement , l' apparition d' une mutation peut conduire à l' inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs . Par exemple , la protéine pRB , régulant le cycle cellulaire , est retrouvée sous une forme mutée inactive dans les cas de rétinoblastomes . La protéine p 53 est aussi sous forme mutée non active dans de très nombreux cas de cancers de la peau . Il a par exemple été montré que des « points chauds » hautement mutables par les dommages UV induits sont présents dans le gène codant pour p 53 . Certaines mutations peuvent aussi conduire à l' activation de proto-oncogènes , par exemple la protéine G de signalisation Ras , où la modification de son activité GTPase induit une transduction du signal permanente . Mais , les modifications de bases ne sont pas les seuls dommages de l' ADN pouvant conduire au phénomène de cancérisation . La formation de coupures dans l' ADN peut engendrer des réarrangements chromosomiques favorisant par exemple l' échange de promoteurs . Un gène ayant subi une telle modification voit son niveau d' expression modifié . Le proto-oncogène MYC est très souvent activé par des réarrangements d' ADN le plaçant sous le contrôle d' un promoteur fort . Il est intéressant de noter que le processus de cancérisation nécessite des mutations dans plusieurs gènes afin d' obtenir une cellule transformée . Il faut que la cellule échappe à l' apoptose ( ex : inactivation de p 53 , expression constitutive de hTERT ) , ne régule plus son cycle cellulaire ( ex : inactivation de pRB ) , que les voies de prolifération soient activées ( ex : activation de RAS ) . Toutes ces modifications d' activité enzymatique nécessitent des mutations dans les gènes correspondants . La probabilité de muter un ou plusieurs de ces gènes en même temps est très faible , cependant ces multiples mutations sont bien présentes dans les cellules tumorales . Deux mécanismes peuvent expliquer ce phénomène . Premièrement l' hypothèse décrite par L . A . Loeb basée sur l' apparition d' une mutation primaire dans un gène des systèmes de réparation ou dans celui d' une polymérase conférant ainsi à la cellule un « phénotype mutateur » générant un grand nombre de mutations . Ce phénotype permet alors à la cellule d' acquérir toutes les mutations nécessaires à sa transformation . Une autre hypothèse avancée par B. Vogelstein , est basée sur une vision Darwinienne du processus de cancérisation . Selon sa théorie , des mutations aléatoires surviendraient dans le génome , parfois dans des gènes nécessaires au processus de cancérisation cellulaire . Des sélections clonales successives opéreraient alors sur ces gènes mutés en fonction de l' environnement , permettant ainsi l' émergence d' un clone tumoral . A la vue de ces deux hypothèses , où l' une donne à la réparation une place centrale et l' autre confère un rôle important à l' environnement cellulaire , on peut penser que ces deux mécanismes existent et peuvent en synergie cumulative contribuer à la transformation cellulaire ( Figure 11 ) . Figure 11 : Schéma bilan présentant les différentes étapes du processus de carcinogenèse . On comprend donc toute l' importance des systèmes de réparation à travers leur double implication dans le processus de cancérisation cellulaire . En effet , ils jouent un rôle d' élément déclencheur dans le cas de dommages non réparés présents dans des proto-oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs , mais aussi d' accélérateur du processus de carcinogenèse s' ils viennent à devenir inactifs . L' aptitude qu' ont nos cellules à maintenir l' intégrité de leur génome est donc corrélée en partie à leur capacité à ne pas devenir cancéreuse . Nous aborderons plus loin le fait que nous ne sommes pas tous égaux en terme de capacité de réparation de l' ADN , et que le polymorphisme de nos gènes de réparation fait que certains individus sont plus enclins que d' autres à développer certaines formes de cancer . 2 . Implication de la réparation de l' ADN dans le phénomène de résistance au traitement par chimiothérapie et radiothérapie a ) Le traitement des cancers et la résistance au traitement Les traitements les plus largement utilisés pour lutter contre le cancer sont les chimiothérapies , et les radiothérapies . Ces deux méthodes de traitement ont pour but , notamment , de créer des dommages dans l' ADN cellulaire . Leur concept est basé sur deux constatations . Premièrement , quand l' ADN d' une cellule est trop endommagé et qu' elle ne peut le réparer , sa division cellulaire est arrêtée et elle peut alors mourir par apoptose . La seconde constatation est que les cellules cancéreuses se divisent de manière très rapide . Si des dommages sont présents dans leur ADN , elles ont donc moins de temps pour les réparer que des cellules saines qui elles ont des divisions plus lentes . Très tôt les oncologues ont eu l' idée , en ajustant la quantité de dommages formés et les intervalles des traitements , d' induire spécifiquement la mort des cellules tumorales en endommageant leur génome . L' utilisation de rayonnement ionisant comme les rayons X , de radio-mimétiques comme la doxorubicine , mais aussi d' agents alkylants mono ou bi fonctionnels comme le cisplatine , le cyclophosphamide , le melphalan , les nitroso-urées , ont permis et permettent toujours de traiter un grand nombre de cancers : 50 % des patients atteints de cancer subiront des chimiothérapies , et 70 % une radiothérapie . Cependant l' utilisation de ces méthodes s' est révélée dans certains cas inefficace , ceci étant dû à l' apparition de résistances lors du traitement . L' étude de ce processus de résistance a permis de mettre en lumière son caractère multifactoriel dont la conséquence est une diminution de la réponse à la chimiothérapie ou à la radiothérapie . Nous allons brièvement aborder ces différentes voies . Tout d' abord , cette résistance au traitement peut passer par une diminution de la concentration cellulaire de la molécule thérapeutique , et ce par deux mécanismes distincts : une diminution de l' entrée de la molécule dans la cellule , ou un relargage dans le milieu extracellulaire via des transporteurs de type ABC . Une autre possibilité pour la cellule cancéreuse de devenir résistante à la chimiothérapie est d' inactiver la molécule chimique en la métabolisant . On peut citer deux protéines impliquées dans ce mécanisme , la glutathion-S-transférase , et la métallothionéine qui ont la capacité de réagir avec les agents alkylants et ainsi de les neutraliser . En outre , ce mécanisme de résistance peut aussi passer par la perte du déclenchement de la mort cellulaire par apoptose , par exemple par la perte de l' activité de la protéine p 53 . Dans ce cas , les cellules ne répondent alors plus par la mort apoptotique à une présence importante de dommages dans leur ADN . Le dernier mécanisme cellulaire permettant aux cellules cancéreuses d' échapper à l' effet des traitements par chimiothérapies et radiothérapies est une augmentation de leur activité de réparation de l' ADN , leur conférant la capacité de corriger les dommages plus rapidement , et ce , de manière adaptée à leur cycle cellulaire . Il est important de noter que les deux premiers facteurs de résistance au traitement ( une diminution de l' assimilation , et une inactivation par métabolisation du composé thérapeutique ) ne sont pas en jeu dans le cas de l' utilisation de rayonnements , en effet les rayonnements accèdent directement à leur cible qu' est l' ADN . Enfin , ces mécanismes de résistance étant indépendants les uns des autres , un effet cumulatif peut donc avoir lieu , rendant la cellule d' autant plus résistante au traitement . Ce statut de haute résistance peut être acquis par sélection clonale au cours du traitement selon le même mécanisme que celui décrit par B. Vogelstein lors du processus de carcinogenèse . b ) Les différents systèmes de réparation de l' ADN et les résistances qu' ils confèrent Nous avons vu que les systèmes de réparation participent au processus de résistance au traitement lorsque leurs activités sont exacerbées . Nous allons maintenant aborder l' implication de chaque système de réparation dans la résistance aux différents traitements utilisés . L' inhibition des systèmes de réparation est un axe de recherche en plein essor , afin de potentialiser les traitements de chimiothérapie et radiothérapie , nous présenterons aussi les molécules développées dans ce but . Résistance liée à la O6-MGMT Nous avons abordé le mode fonctionnement de la O6-MGMT dans le chapitre dédié aux systèmes de réparation . Cette protéine est spécialisée dans la réparation des bases alkylées notamment en position O6 de la guanine , or certains traitements par chimiothérapie sont basés sur l' alkylation des bases de l' ADN . Les dérivés de nitroso-urée tels que le BCNU ou le CCNU ainsi que la dacarbazine et la procarbazine pour ne citer qu' eux , alkylent tous l' adénine en position N3 mais aussi la guanine en position N7 et plus faiblement en O6 . Cependant la modification en O6 de la guanine est fortement mutagène . On comprend aisément l' implication de la O6-MGMT dans le processus de résistance à ce type de traitement . En effet , l' expression de la O6-MGMT se trouve augmentée dans de nombreux cas de cancer . Cette augmentation de l' expression de la O6-MGMT est due à une activation de son promoteur . Pour agir sur le niveau d' activité élevé de la O6-MGMT dans le but de le diminuer , des méthodes thérapeutiques ont été développées comme , par exemple , l' utilisation d' inhibiteurs directs tels que la O 6 -benzylGuanine , la MGMT . Résistance liée à la réparation par excision de base La REB est capable de réparer les bases alkylées , notamment les alkylations en N7 de la guanine et N3 de l' adénine . Elle joue donc un véritable rôle de complément à l' AGT qui elle est spécifique de la position O6 de la guanine . Son rôle dans la résistance aux traitements à base d' agents alkylants est donc aussi important . Il a été mis en évidence au cours d' études pré-cliniques où l' inhibition de la REB a permis d' augmenter la sensibilité aux agents alkylants . Plusieurs stratégies sont utilisées pour diminuer l' activité de la REB dans les cellules tumorales . Elles visent toutes des points clés du mécanisme comme le blocage de l' étape de resynthèse par la polymérase & 206;& 178; , l' inhibition de APEX1 pour empêcher la coupure du brin d' ADN au niveau de sites abasiques , l' inactivation de la PARP en vue d' inhiber le recrutement de la polymérase & 206;& 178;. L' inhibition d' APEX 1 et de la PARP sont des axes de recherche très privilégiés car ces deux protéines sont aussi impliquées dans la réparation des cassures de brins , et pourraient donc aussi potentialiser la radiothérapie . Des inhibiteurs existent concernant ces protéines , le Lucanthone pour APEX1 , l' acide pamoïque pour la polymérase & 206;& 178; , l' AG 014699 & 194;& 174; le INO- 1001 & 194;& 174; et le CEP- 6800 & 194;& 174; pour la PARP . Résistance liée à la réparation par excision de nucléotides Le cisplatine peut conduire à la formation de plusieurs types d' adduits sur l' ADN , comme des pontages inter-brins ainsi que des pontages intra-brin . Les pontages inter-brins ne sont cependant pas les adduits majoritaires générés par le cisplatine : environ 2 % contre 98 % d' adduits intra-brin . L' effet des pontages inter-brin est cependant très important car ils bloquent physiquement l' ouverture de l' ADN empêchant ainsi la réplication et la transcription . La REN est impliquée à la fois dans la réparation des pontages inter et intra-brin . Lors de la réparation des pontages inter-brins , elle réalise l' étape d' excision uniquement , la suite de la réparation étant prise en charge par soit la RNH , soit la RH . La réparation des pontages intra-brin , quant à elle , est entièrement prise en charge par la REN . Dans les cas de résistance au traitement par le cisplatine , la protéine ERCC1 se retrouve , dans la plupart des cas , surexprimée . ERCC1 est impliquée dans l' étape limitante d' excision lors de REN . Elle serait donc autant impliquée dans la résistance aux pontages inter-brins que intra-brin . La réparation par excision de nucléotides peut être aussi responsable de la résistance à certains agents alkylants monofonctionnels . En effet , plus la taille du groupe alkylé devient importante et déforme la structure de la double hélice , moins elle est réparée par la O6-MGMT ou la REB , et plus sa réparation est alors prise en charge par la REN . Il est intéressant de constater qu' aucun inhibiteur de la REN n' a encore pu être développé , et ce malgré son importance dans la résistance aux traitements chimiothérapeutiques . Résistance liée à la recombinaison non homologue ( RNH ) La RNH est tout d' abord impliquée dans des phénomènes de résistance lors des traitements par radiothérapie . En effet , ce type de traitement crée des cassures double brin dans la double hélice d' ADN qui sont prises en charge dans la cellule par la RNH . Une surexpression de DNA-PKcs a été démontrée dans des cas de patients présentant des résistances au traitement par radiothérapie . La RNH est aussi impliquée dans la résistance aux agents alkylants bifonctionnels , tels que les dérivés du gaz moutarde ou le cisplatine . Ces composés conduisent , comme nous l' avons vu , à la formation de pontages inter-brins dans l' ADN . Il a été démontré que la réparation de ces pontages nécessite la RNH . En effet , des cellules mutées pour les protéines Ku 70 , Ku 86 , DNA-PKcs , XRCC4 présentent une hypersensibilité à divers agents pontants de l' ADN . Cette double implication de la RNH en fait une cible de choix pour potentialiser les traitements de chimiothérapie et de radiothérapie . Plusieurs inhibiteurs de DNA-PKcs ont notamment vu le jour : le IC 87361 & 194;& 174; , le NU 7026 & 194;& 174; , le Vanillin& 194;& 174; , le SU 11752 & 194;& 174; , la Salvicine& 194;& 174;. Résistance liée à la recombinaison homologue ( RH ) La recombinaison homologue , contrairement à la RNH , nécessite la présence d' une chromatide soeur pour réaliser la réparation de cassures dans l' ADN . Dans les cellules saines , l' implication de la recombinaison homologue dans la réparation des cassures double brin est donc très restreinte car une grande partie des cellules ne se divisent pas ou peu . Au contraire , dans le cas de cellules cancéreuses , nous sommes dans un tout autre schéma , puisque les phases de divisions s' enchaînent rapidement . La recombinaison homologue est donc beaucoup plus sollicitée . Ce mécanisme de réparation est impliqué au même titre que la RNH dans la résistance aux traitements induisant des cassures dans l' ADN , à savoir les radiothérapies et certaine chimiothérapies . Il a en effet été démontré que la recombinaison homologue intervient dans la réparation des pontages inter-brins ; au cours de cette étape , elle joue le même rôle que la RNH . Enfin , la recombinaison homologue est aussi en jeu lors de la réparation des cassures double brins générées par les rayonnements lors des radiothérapies . Cette idée a notamment été confortée lors d' expériences menées sur des souris où la surexpression de Rad 51 induit une radiorésistance , et au contraire une suppression du gène Rad 54 conduit à une hypersensibilité aux rayonnements ionisants . Tout comme la RNH , la double implication de la réparation par recombinaison homologue dans le processus de résistance au traitement de chimio et radiothérapie fait de ce mécanisme une cible intéressante . Un seul inhibiteur a pour le moment été découvert , il s' agit du KU- 55933 & 194;& 174; , qui a pour cible ATM . Tout comme ATR , ATM est un senseur de dommage capable d' activer des voies de signalisation agissant notamment sur le cycle cellulaire et sur la recombinaison homologue . Résistance liée à la réparation des mésappariements Le mécanisme de réparation des mésappariements est capable de réparer les boucles d' insertion et de délétion ainsi que les mésappariements de bases . Il semblerait qu' il possède aussi la capacité de réparer les pontages intra-brin causés par le cisplatine . Cette capacité de réparer les dommages formés par le cisplatine pourrait permettre , à travers une surexpression des gènes de ce système de réparation , d' acquérir une résistance à ce composé , or ce n' est pourtant pas le cas . En effet le système de réparation des mésappariements confère à la cellule une résistance au traitement de chimiothérapie par perte d' activité des gènes MSH2 ou MLH1 . Cette particularité vient du fait que ce système , en plus de son activité de réparation , est aussi capable d' induire l' apoptose si un trop grand nombre de dommages causés , par exemple , par le cisplatine sont présents dans l' ADN . Une cellule ayant perdu ce système de réparation peut donc devenir résistante au cisplatine , mais cette résistance est aussi étendue à d' autre agents alkylants . Il est à noter que cette perte d' activité de réparation confère en plus à la cellule un phénotype lui permettant d' accumuler des mutations favorisant ainsi le processus de carcinogenèse ; en effet , elle n' est plus en mesure de réparer les erreurs post réplicationnelles normalement prises en charge par ce système de réparation . Etant données les caractéristiques de cette résistance , aucune molécule permettant de restaurer cette activité de réparation n' a pour le moment été découverte . 3 . Effets secondaire liés aux traitements par chimiothérapie et radiothérapie Les chimiothérapies et radiothérapies sont des traitements qui provoquent sur l' organisme du patient un stress important et peuvent avoir des conséquences à court et long terme graves . a ) Les cancers secondaires Les cancers secondaires sont une complication grave pouvant survenir après une chimiothérapie ou une radiothérapies . Ces traitements peuvent avoir chez certains patients un effet carcinogène conduisant à l' apparition de tumeurs secondaires solides mais aussi et surtout hématologiques . Un lien direct a pu être démontré entre certains traitements par chimiothérapie et l' apparition de cancers secondaires , par exemple lors de traitement de leucémies par des agents alkylants et lors de traitements de cancers de la vessie avec des cyclophosphamides . Les cancers hématologiques secondaires les plus souvent décrits sont des leucémies aigües , des lymphomes non-Hodgkiniens , des myelodysplasies . Il semblerait que le risque maximal de cancer secondaire leucémique se situe dans une période de 5 à 10 ans après le début du traitement chimiothérapeutique , et qu' il diminue ensuite . Le suivi des patients est donc très important . Cette susceptibilité à développer des cancers secondaires présentés par une partie des patients , pourrait dans certains cas être liée à leur capacité de réparation de l' ADN . En effet , un patient présentant des capacités de réparation de l' ADN inférieures à celles généralement rencontrées dans la population pourrait , s' il subit une chimiothérapie ou une radiothérapie conventionnelle , accumuler des dommages dans ces cellules saines conduisant à l' apparition de mutations carcinogènes . b ) Hypersensibilité aux traitements L' hypersensibilité est un autre effet secondaire des traitements par chimiothérapie et radiothérapie . Dans le cas de chimiothérapies cette hypersensibilité se traduit par des réactions cutanées telles que l' apparition de rougeurs , des crises urticaires , des troubles respiratoires et cardiovasculaires ( bronchospasmes , hypotension ) . Dans le cas de l' utilisation de carboplatine , des problèmes d' hypersensibilité apparaissent chez 1 % des patients recevant moins de six cures de carboplatine , et grimpe à 27 % pour les patients subissant plus de sept cures . Des cas d' hypersensibilité aux radiothérapies existent aussi , ils concernent à peu prés 5 % des patients . Lors de traitements de cancer du sein , par exemple , les symptômes peuvent être cutanés : des érythèmes , des oedèmes , des desquamations . Les effets à plus long terme sont des fibroses et des télangiectasies . La conséquence des hypersensibilités sévères liées aux chimiothérapies et aux radiothérapies est de conduire à l' arrêt du traitement . Pour pallier à ce problème , des protocoles de désensibilisation ont été testés , et se sont révélés efficaces dans certains cas de traitement par chimiothérapie . L' utilisation d' anti-histaminiques et de corticoïdes a aussi permis de diminuer les problèmes d' hypersensibilité , car elle est en partie liée à un phénomène allergique . Toutefois de récents travaux tendent à montrer que , au moins pour l' hypersensibilité liée aux radiothérapies , les systèmes de réparation pourraient être impliqués dans ce phénomène . En effet certains polymorphismes des gènes XRCC1 , ATM semblent favoriser l' hypersensibilité , il a aussi été montré que la protéine Rad 50 pourrait être impliquée dans ce phénomène . Les capacités de réparation des patients pourraient aussi , tout comme dans le cas des cancers secondaires , être un facteur contribuant à l' apparition d' hypersensibilités . 4 . Conclusion Les mécanismes de réparation de l' ADN jouent un rôle important dans le processus de cancérisation et de résistance aux traitements par chimio et radiothérapie . Ils pourraient aussi jouer un rôle dans l' apparition de cancers secondaires et dans l' hypersensibilité aux traitements . Cette ambivalence les fait apparaître comme un véritable « couteau à double tranchant » pour la cellule . Ainsi , si un niveau de réparation élevé permet d' éviter l' accumulation de dommages dans des gènes impliqués dans le processus de carcinogenèse , il peut aussi être responsable d' une résistance aux traitements . A l' inverse , un niveau d' activité de réparation faible pourrait être favorable au processus de carcinogenèse . Il favoriserait l' efficacité des traitements de chimiothérapie et radiothérapie , mais pourrait être en partie responsable de l' induction des cancers secondaires ou des réactions d' hypersensibilité . Un équilibre délicat existe donc entre le niveau de réparation de nos cellules , la quantité de dommages auxquels elles ont à faire face , et le processus de carcinogenèse . B . Les maladies génétiques liées à des gènes impliqués dans la réparation Un défaut dans les mécanismes de réparation peut conduire à un processus de cancérisation . Nous allons voir que la plupart des maladies génétiques portant sur des gènes de réparation conduisent au développement de cancers ou dans certains cas à des dégénérescences neuronales . Nous aborderons les maladies génétiques liées spécifiquement à des défauts dans les gènes de réparation , nous ne parlerons pas ou très succinctement des maladies génétique liées à des défauts de la régulation des activités de réparation portées par exemple sur les gènes ATM ou BRCA . 1 . Xeroderma pigmentosum pigmentosum Xeroderma pigmentosum pigmentosum est une maladie génétique dont le premier cas a été décrit par le dermatologue Autrichien Ferdinand Ritter von Hebra en 1870 . Il a donné le nom de Xeroderma à cette maladie , ce mot latin signifiant littéralement « peau en parchemin » . Le terme pigmentosum fut rajouté plus tard pour souligner les problèmes importants de pigmentation dont souffrent les personnes atteintes . Il faudra attendre 1968 pour que les scientifiques s' intéressent à cette maladie , et cette rencontre est en partie due au fruit du hasard . En effet , J.E . Cleaver , qui travaillait alors sur la réparation de l' ADN , cherchait désespérément à obtenir des mutants afin de réaliser des expériences de complémentations et ainsi valider ses travaux sur la REN . C' est en parcourant un journal local que son attention fut attirée par un article traitant de la maladie Xeroderma pigmentosum pigmentosum , la décrivant comme une maladie héréditaire prédisposant au cancer induit par le soleil . Il eut alors rapidement l' intuition que cette maladie devait être liée à une déficience des systèmes de réparation , il réussit à obtenir des biopsies de peau de patients , et il montra que leurs fibroblastes présentaient un défaut de réparation de l' ADN après une exposition aux UV . La compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette maladie pouvaient alors débuter . a ) Les bases moléculaires du Xeroderma pigmentosum pigmentosum Xeroderma pigmentosum pigmentosum est une maladie autosomale récessive et les gènes codant pour les protéines XP sont tous sur des loci appartenant à des chromosomes différents ( Tableau 3 ) . Les travaux sur Xeroderma pigmentosum pigmentosum , notamment ceux de J.E. Cleaver , ont permis de mettre en évidence sept groupes de complémentation : XP-A , XP-B , XP-C , XP-D , XP-E , XP-F et XP-G. Un huitième groupe XP-V a par la suite été découvert . Tableau 3 : Tableau présentant les différents loci des gènes XP Les groupes de complémentation de XP-A à XP-G correspondent tous à des protéines impliquées dans la REN auxquelles ils ont donné leurs noms ( XPA , XPB , etc ) . Les personnes porteuses de mutations pour l' un de ces gènes sont donc déficientes pour le système de REN impliqué dans la réparation globale du génome . Ceci a été démontré par la faible capacité qu' ont leurs fibroblastes à incorporer de la thymidine tritiée après une irradiation UV . L' étude des différentes mutations et les phénotypes qui en découlent ont permis de mettre en évidence que plusieurs facteurs peuvent moduler la sévérité des cas de Xeroderma pigmentosum pigmentosum . Premièrement entre en jeu la conséquence que va avoir la mutation sur la protéine XP , par exemple l' apparition d' un codon stop , un décalage du cadre de lecture , ou une modification de l' épissage de son ARNm peuvent conduire à des cas particulièrement sévères . Une mutation faux-sens peut donner un phénotype moins prononcé . Le deuxième facteur influençant le degré de sévérité est la fonction du gène XP muté . Par exemple , des mutations dans le gène XPE conduisent à des symptômes moins sévères que des mutations dans le gène XPC qui est essentiel au recrutement des protéines de la REN . Le huitième groupe de complémentation quant à lui est nommé XP-V , le V étant l' abréviation du mot variant . Le gène XPV n' est pas impliqué dans la réparation par excision de nucléotides , mais dans la synthèse translésionelle des dommages UV induits et code pour la polymérase & 206;& 183;. Les cellules déficientes pour la protéine XPV ne sont donc plus capables de réaliser une synthèse translétionelle non mutagène des dommages UV induits . b ) Les caractéristiques cliniques Les patients atteints de Xeroderma pigmentosum pigmentosum présentent de nombreux troubles cutanés , comme des défauts de pigmentation , certaines zones sont dépigmentées alors que d' autres sont hyperpigmentées . Leur peau est caractérisée par un vieillissement accéléré , et présente un nombre très important de taches de rousseur . Le défaut de réparation des dommages UV que présentent les patients atteints de Xeroderma pigmentosum pigmentosum les rend particulièrement prédisposés aux cancers cutanés . Leur risque de développer un mélanome est 2000 fois supérieure à celle d' un individu sain ; pour les autres types de cancer cutané , leur prédisposition est 4800 fois supérieure à la normale . Cette prédisposition aux cancers cutanés se manifeste précocement en moyenne à l' age de 8 ans chez les patients XP contre 50 - 60 ans dans la population . La prédisposition à d' autres types de cancer devrait elle aussi théoriquement être supérieure à celle d' individus sains , cependant l' espérance de vie courte ainsi que le faible nombre de malades ne permet pas de mettre en évidence ce phénomène . Outre les problèmes cutanés , les personnes atteintes de Xeroderma pigmentosum pigmentosum présentent aussi des problèmes oculaires au niveau des paupières , de la cornée , mais aussi buccaux au niveau de la langue et des lèvres , ces zones étant particulièrement sensibles au rayonnement UV . On comprend alors que la seule indication pour les personnes atteintes de Xeroderma pigmentosum pigmentosum est une absence totale d' exposition au rayonnement UV . Enfin , la dernière caractéristique clinique présentée par 20 à 30 % des personnes atteintes de Xeroderma pigmentosum pigmentosum est une dégénérescence neurologique caractérisée par une mort neuronale prématurée , un retard mental et une microcéphalie . Ces problèmes neurologiques pourraient être expliqués par une accumulation de dommages dans les neurones qui les conduirait à la mort par apoptose . En effet , les neurones ayant un métabolisme élevé , produisent beaucoup d' espèces réactives de l' oxygène , leur ADN est par conséquent d' autant plus endommagé . Une implication de la REN dans la réparation des dommages oxydatifs , pourrait expliquer pourquoi des personnes atteintes de Xeroderma pigmentosum pigmentosum présentent une dégénérescence neurologique et renforcerait l' idée d' une complémentarité des systèmes de réparation . c ) Prévalence démographique et géographique Des cas de Xeroderma pigmentosum pigmentosum sont présents dans le monde entier , mais l' incidence de cette maladie varie en fonction des populations . Elle est de 1 pour 250 000 en Europe et aux Etats Unis , alors qu' elle atteint 1 pour 40 000 au Japon , une incidence élevée et aussi présente en Egypte . Mais cette répartition est également dépendante du type de gènes XP mutés , par exemple la mutation la plus fréquente au Japon porte sur le gène XPA , alors qu' en Europe ce sont les gènes XPC et XPD qui sont les plus touchés ( Tableau 4 ) . Les taux de mutation sur XPV au Japon et en Europe sont comparables . Tableau 4 : Tableau présentant le nombre cas de personnes atteintes de Xeroderma pigmentosum pigmentosum , en fonction du type de gène muté et de la localisation géographique . 2 . Le syndrome de Cockayne Le syndrome de Cockayne est une maladie très rare qui a été décrite pour la première fois au milieu des années trente par le pédiatre Edward Alfred Cockayne , qui donna son nom à ce syndrome . a ) Les bases moléculaires du syndrome de Cockayne ( CS ) Ce syndrome est une maladie autosomale récessive . Deux groupes de complémentations ont été découverts , CS-A et CS-B , et ont donné leur nom aux protéines CSA et CSB . 80 % des personnes touchées sont mutées pour CSB , les 20 % restant le sont pour CSA . Ces deux protéines sont impliquées dans le recrutement des protéines de la REN lors de la réparation couplée à la transcription . Les personnes atteintes du syndrome de Cockayne sont donc déficientes en réparation couplée à la transcription , mais présentent une réparation globale du génome par la REN parfaitement fonctionnelle . Cette déficience dans la réparation couplée à la transcription a été déduite de l' observation du phénotype des cellules de patients CS , qui voient leur synthèse d' ARN très fortement inhibée à la suite d' une irradiation UV . Cette caractéristique est utilisée lors des tests permettant de diagnostiquer cette maladie . Il est intéressant de noter qu' il n' apparaît pas de différences au niveau clinique ou cellulaire entre l' un ou l' autre des deux groupes de complémentation , et que les études génétiques menées sur les patients n' ont pas permis de mettre en évidence une corrélation entre le type de mutation et le degré de sévérité de la maladie . b ) Caractéristiques cliniques Les personnes atteintes du syndrome de Cockayne présentent une petite taille , leur croissance étant souvent arrêtée à un âge très précoce , et elles souffrent de rachitisme . Elles sont aussi victimes d' un vieillissement prématuré et présentent des membres , bras et jambes , disproportionnés par rapport à leur tronc , et un visage aux traits typiques : grandes oreilles , grand nez , yeux renfoncés . Certains d' entre eux souffrent d' anomalie occulaire , et peuvent développer des cataractes avant l' âge de trois ans . Contrairement aux patients XP , ils ne présentent pas de prédispositions aux cancers cutanés ni à d' autres types de cancers , et ce , bien que leur peau soit photosensible . A l' inverse des patients XP , les personnes atteintes par le syndrome de Cockayne présentent une dégénérescence neurologique causée par une démyélinisation qui réduit leur espérance de vie à douze ans . Cette dégénérescence serait causée par une accumulation de dommages oxydatifs dans l' ADN des neurones , comme c' est les cas par exemple chez certains patients XP . Le fait que tous les patients CS aient des troubles neuronaux suggère que la réparation couplée à la transcription pourrait être impliquée dans la réparation des dommages oxydatifs . Cette constatation alimente donc les interrogations quant à l' existence d' un lien entre la REB et la réparation couplée à la transcription , mais aussi d' une possible réparation des dommages oxydatifs par la REN . Cependant , une autre théorie pourrait expliquer cette dégénérescence des neurones par une accumulation de dommages . Elle suppose qu' une diminution de la transcription de gènes impliqués dans la réparation de l' ADN serait causée par la présence importante de lésions . Il en résulterait alors une baisse du niveau de transcription des gènes de réparation touchés , et par conséquent une baisse de l' activité de réparation de l' ADN conduisant à l' accumulation de dommages . c ) Prévalence démographique et géographique Plus de 180 cas ont été répertoriés dans le monde jusqu'à ce jour , aucune incidence précise n' a pu être déterminée , mais il semblerait qu' elle soit nettement inférieure à 1 cas pour 100 000 personnes . Il ne semble pas y avoir comme pour le Xeroderma pigmentosum pigmentosum une prévalence géographique liée à une population particulière d ) Le cas particulier du Syndrome de Cockayne combiné au Xeroderma pigmentosum pigmentosum ( XP / CS ) Certains cas rares de personnes présentant un Syndrome de Cockayne combiné au Xeroderma pigmentosum pigmentosum ont été recensés . Dans le cas du XP / CS les protéines mutées sont soit XPD , XPB ou XPG . Les protéines XPD et XPB , nous l' avons vu , font partie du complexe TFIIH impliqué dans la transcription ainsi que dans la REN ; XPG quant à elle est une des deux endonucléases du système de réparation par excision de nucléotides . Les personnes atteintes possèdent les caractéristiques cliniques du Syndrome de Cockayne , mais aussi une prédisposition aux cancers cutanés comme les patients atteints de Xeroderma pigmentosum pigmentosum . 3 . Trichothiodystrophie ( TTD ) La trichotiodystrophie est une maladie génétique très rare ( sa prévalence n' est pas connue ) , elle a été décrite pour la première fois en 1968 par R. J. Pollitt , le nom trichotiodystrophie ne sera attribué que plus tard . a ) Base moléculaire de la Trichothiodystrophie ( TTD ) La trichothiodystrophie , tout comme le Syndrome de Cockayne et le Xeroderma pigmentosum pigmentosum , est une maladie autosomale récessive . Deux groupes de complémentation existent , il s' agit de XP-B et XP-D. Les mutations portent donc sur les mêmes gènes que dans le Syndrome de Cockayne combiné et le Xeroderma pigmentosum pigmentosum , cependant le phénotype des patients atteints de trichothiodystrophie est différent . Les cellules de malades présentent un défaut dans leurs activités transcriptionelles , le complexe TFIIH étant déstabilisé par la protéine mutée . De plus , environ 50 % des personnes souffrant de cette maladie présentent aussi un niveau de réparation par excision de nucléotides réduit . b ) Caractéristiques cliniques Les personnes atteintes de trichothiodystrophie présentent une petite stature , un retard mental , une peau ichthyotique , et des traits de visage spécifiques . Ils possèdent aussi des cheveux très cassants à cause d' une déficience en protéines de matrice riches en cystéines . Leurs cheveux présentent la particularité d' être « rayés » lorsqu' on les observe sous une lumière polarisée . Enfin , une partie des malades présente une photosensibilité accrue due à une déficience dans la REN . Certains cas de personnes présentant une trichothiodystrophie combinée avec un Xeroderma pigmentosum pigmentosum ont été recensés . L' existence de cas de XP / TTD ainsi que de XP / CS montre toute la subtilité des maladies génétiques XP , CS et TTD . En effet , si ces trois maladies peuvent être causées par des modifications dans les mêmes protéines XPB et XPD , il n' en reste pas moins que les phénotypes qui en résultent sont différents . Les protéines XPB et XPD sont impliquées , nous l' avons vu , dans au moins deux mécanismes cellulaires qui sont la réparation et la transcription ; les mutations touchant ces gènes peuvent donc avoir différents effets et causer différents phénotypes en fonction de leur type et de leur position . Soit la mutation touche l' une ou l' autre des fonctions de XPB et XPD , et l' on obtient alors l' un des trois phénotypes XP , CS ou TTD , soit la mutation affecte plusieurs fonctions et il en résulte un phénotype combiné XP / CS et XP / TTD . A cela vient s' ajouter toute la complexité de l' hétérogénéité allélique . En effet , il ne faut pas perdre de vue que le phénotype est lié à l' expression de deux gènes mutés , tous deux portant une modification dans la même protéine . Ces deux modifications ne sont pas forcement situées au même endroit dans la protéine et ne sont pas non plus de même type . La combinaison de l' expression des deux protéines modifiées influence aussi directement le phénotype . Les mécanismes moléculaires des maladies génétiques liées aux protéines XPB et XPD sont donc très complexes , et soulignent toute la complexité des interactions protéiques au sein de TFIIH et leurs différentes conséquences . 4 . Le cancer du colon héréditaire non-polyposique ( CCHNP ) Le cancer du colon héréditaire non-polyposique ou syndrome de Lynch a été décrit pour la première fois par Aldred Warthin en 1913 . Ce syndrome est hérité de manière autosomale dominante et représente de 1 à 3 % des cancers colorectaux . 80 % des personnes porteuses de cette maladie génétique développent un cancer du colon précoce , l' âge moyen du diagnostic étant de 45 ans . La maladie se caractérise par l' apparition d' un nombre fini d' adénomes au niveau du colon , qui peuvent devenir rapidement malins . Des tumeurs extracoloniques peuvent aussi se former au niveau de l' utérus , de l' estomac , des ovaires , des reins , et du petit intestin . Plus rarement , elles peuvent apparaître au niveau du cerveau ( glioblastome ) , ou de la peau . La maladie doit donc être diagnostiquée très tôt afin de surveiller les patients et pouvoir ainsi retirer , s' il le faut , les adénomes rapidement . Cette maladie génétique est causée par une mutation dans les gènes du système de réparation des mésappariements . Dans 90 % des cas ce sont les gènes hMSH 2 ou hMLH 1 qui sont mutés . Les mutations portant sur hPMS 1 , hMSH 6 , hPMS 1 font partie des 10 % restant . Les personnes atteintes par cette maladie sont hétérozygotes pour le gène muté . Le système de réparation des mésappariements n' est donc plus fonctionnel uniquement lorsque l' allèle sauvage est inactivé . La perte d' activité de l' allèle sauvage et le fait qu' il soit localisé spécifiquement dans le colon n' ont pas encore été élucidés . Les cellules de l' épithélium colorectal devenues déficientes en réparation des mésappariements acquièrent alors un statut mutateur générant une forte instabilité génomique , la cellule n' étant plus capable de corriger les erreurs introduites lors des réplications . Ces cellules sont alors caractérisées par une fréquence élevée de microsatellites instables . Les microsatellites sont des séquences d' ADN composées de répétitions de di-nucléotides . Ces microsatellites sont une source importante de formation de boucles d' insertion ou de délétion lors de la réplication . Dans le cas du CCHNP , ces boucles ne sont pas réparées , et donc la taille et la localisation des microsatellites ne sont plus fixes . Cette caractéristique est un des facteurs utilisés pour diagnostiquer les cas de CCHNP , avec aussi la réalisation d' un arbre phylogénétique afin d' étudier l' apparition et la distribution de la maladie dans la famille . 5 . Réparation de l' ADN et polymorphisme génétique Dans ce dernier sous chapitre , nous allons aborder le polymorphisme des gènes de réparation de l' ADN et leur implication dans la prédisposition au cancer . Le polymorphisme génétique correspond aux différents allèles d' un gène dont la représentation dans une population d' individus est supérieure à 1 % . Il résulte en partie de micro variations de séquences qui existent pour un même gène donné . Les variations présentes dans nos gènes peuvent avoir des conséquences sur la fonctionnalité des protéines . En effet , ces variations de séquences peuvent porter sur le site actif d' une protéine et ainsi agir sur son activité , mais elles peuvent également porter sur des motifs d' interaction avec l' ADN , ou d' interactions avec d' autres protéines . Ainsi le pool de gènes codant pour les protéines de réparation que nous possédons est spécifique à chaque être humain , les activités de ces protéines font partie de notre phénotype au même titre que la couleur de nos yeux , de nos cheveux . Nous ne sommes donc pas tous égaux en terme d' activité enzymatique de réparation . C' est de ces constatations qu' est née l' idée que les variations polymorphiques conduisant à des protéines ayant une activité de réparation de l' ADN plus faible que la normale pourraient prédisposer au cancer . Des études ont été menées pour étudier le polymorphisme des gènes impliqués dans différents systèmes de réparation et il apparaît que des variants polymorphiques existent pour chacun d' entre eux ( Tableau 5 ) . Tableau 5 : Tableau illustrant le polymorphisme des gènes de réparation à travers leurs fréquences d' apparition Il est intéressant de constater que le polymorphisme le plus répandu porte sur les gènes impliqués dans le système de réparation des mésappariements et de la REB . Cette représentativité s' équilibre entre les différents systèmes de réparation de l' ADN pour une fréquence d' apparition entre 5 % et 2 % . Enfin il semblerait que la REB présente le plus grand nombre de variants pour une fréquence d' apparition faible inférieure à 2 % . Nous allons maintenant , pour chaque système de réparation , présenter l' implication du polymorphisme génétique dans la prédisposition au cancer . a ) Polymorphisme des gènes impliqués dans la REB Le polymorphisme le plus étudié pour la réparation par excision de base porte sur le gène XRCC1 , ce gène code pour la protéine XRCC1 qui a une activité centrale dans le mécanisme de la REB car elle permet de coordonner les protéines comme notamment la ligase III et la polymérase & 206;& 178;. Ce gène possède trois variants polymorphiques Arg 194 Trp , Arg 399 Gln , Arg 280 His sur lesquels de nombreuses études ont été réalisées . Le variant Arg 194 Trp chez les personnes homozygotes présenterait une tendance globale à la protection contre plusieurs cancers , notamment du sein , des poumons , de la rate , et de l' estomac . Cette protection est toutefois faible en comparaison des homozygotes Arg / Arg , les rapports de côtes ( odds ratio ) étant aux alentours de 0 , 7 . Les études portant sur les homozygotes Arg 194 Trp ont elles aussi montré un effet faiblement protecteur contre plusieurs cancers : le mélanome , les cancers oesophagiens et les cancers de la rate . Toutefois , dans le cas de ce variant une prédisposition à certains types de cancer à aussi été mise en évidence : cancer du sein , de l' estomac , de la tête et du cou . Le dernier variant Arg 280 His a été moins étudié que les deux autres et surtout sur de plus petites cohortes . Il a cependant été montré que les porteurs homozygote de Arg 280 His étaient plus enclins à développer des cancers du poumon . La protéine APEX1 de la réparation par excision de base possède aussi plusieurs variants , Asp 148 Glu , Gln 51 his , Ile 54 Val . Le variant Asp 148 Glu est le plus étudié des trois , son activité enzymatique a été décrite comme provoquant une hypersensibilité aux rayonnements ionisants . L' étude des données statistiques a permis de mettre en évidence que les porteurs homozygotes ne présentaient pas de prédisposition au cancer du poumon . Pour finir , une étude portant sur le variant Ser 326 Cys du gène OGG1 a montré que les porteurs homozygotes Cys / Cys avaient une prédisposition importante à développer des cancers du poumon . b ) Polymorphisme des gènes impliqués dans la REN Le polymorphisme du gène XPD est celui qui a été le plus étudié , car ce gène présente deux variants , Asp 312 Asn et Lys 751 Gln , très largement représentés dans la population avec une fréquence d' apparition supérieure à 40 % . Le polymorphisme Gln / Gln augmenterait sensiblement les risques de cancer du poumon chez les personnes non fumeuses ( rapport de côtes de 2 ) , cependant ces résultats restent controversés car d' autres études n' ont pas trouvé d' association entre une prédisposition au cancer du poumon et les personnes homozygotes pour ce variant . Les études portant sur le variant Asp 312 Asn ont quant à elles montré que les homozygotes Asn / Asn avaient une probabilité plus élevée de développer un cancer de la prostate ainsi qu' un cancer du poumon lié au tabagisme . Un effet protecteur de cet allèle à toutefois été démontré dans le cas de cancer du poumon non à petites cellules , enfin aucune prédisposition au mélanome n' a pu être mise en évidence . Le gène XPC présente un polymorphisme particulier qui a récemment été découvert . Celui -ci est dû à des insertions / délétions de poly AT ( PAT ) . Lors d' une étude , il est apparu que les personnes homozygotes XPC-PAT + / XPC-PAT + ont un risque significativement plus élevé de développer des cancers de la tête et du cou . Enfin il a été montré que le polymorphisme du gène ERCC1 ne semble pas associé ni avec le mélanome ni avec des gliomes , et que le polymorphisme des zones non transcrites en 5 ' et 3 ' de XPF n' interviendrait pas non plus dans les cas de mélanome . c ) Polymorphisme des gènes de la réparation des cassures double brin Le polymorphisme lié aux gènes de réparation des cassures double brin a été moins étudié que celui des autres systèmes de réparation . Toutefois des études sur le polymorphisme de BRCA2 et XRCC4 ont été menées . BRCA2 est une protéine qui régule la réparation des cassures double brin , elle possède un variant Asn 372 His . Les homozygotes His / His pour le variant Asn 372 His de BRCA2 montrent une plus forte susceptibilité de développer des cancers du sein . Le gène XRCC4 quant à lui coordonne l' étape de ligation lors du processus de réparation , son variant Thr 241 Met a principalement été étudié , et il a été montré que les homozygotes Met / Met ont une forte prédisposition au cancer de la rate , au mélanome , et au cancer du poumon . d ) Conclusion sur le polymorphisme génétique Le polymorphisme des gènes de réparation de l' ADN semble jouer un rôle dans le processus de cancérisation . Toutefois , une corrélation entre une homozygotie pour un variant et une prédisposition à un type particulier de cancer n' est pas toujours constatée . Dans certains cas il semblerait que le variant puisse prévenir l' apparition de cancer . Ces résultats soulignent la complexité des mécanismes mis en jeu dans le polymorphisme génétique . Notamment le fait que nous pouvons posséder des variants polymorphiques pour plusieurs gènes de réparation , affectant plusieurs systèmes de réparation différents , mais aussi plusieurs fois un même système de réparation . Se rajoute à cela la possibilité d' être hétérozygote . Enfin , il ne faut pas oublier les facteurs environnementaux tels que le tabagisme , la consommation d' alcool , et les habitudes alimentaires qui modulent les phénomènes de prédisposition au cancer , rendent complexe l' étude des variants polymorphiques . C . Conclusion sur les maladies liées à la réparation de l' ADN Les systèmes de réparation sont au coeur de plusieurs maladies aussi bien génétiques qu' acquises . Leurs conséquences sont graves , l' issue étant dans la plupart des cas une mort prématurée causée soit par un cancer soit par une dégénérescence neurologique . L' amélioration du traitement de ces maladies passe par deux axes de développement : premièrement par une meilleure compréhension du fonctionnement des mécanismes de réparation afin de mieux pouvoir agir sur ces maladies . Deuxièmement , par une meilleure capacité à évaluer les activités de réparation de l' ADN des cellules , pour permettre un diagnostic plus rapide des maladies génétiques ; mais aussi de mieux appréhender les capacités de réparation de l' ADN du patient et des cellules tumorales afin par exemple d' adapter le traitement anti-cancéreux . Dans ces deux cas , le développement d' outils capables de mesurer les activités des systèmes de réparation de l' ADN est nécessaire . Nous allons aborder dans la troisième partie les différentes techniques permettant de mesurer les activités de réparation de l' ADN . III . Les outils permettant d' étudier la réparation de l' ADN Nous venons de voir qu' il existe un besoin important de pouvoir quantifier les capacités de réparation de l' ADN , aussi nous allons présenter ici quelques-unes des techniques utilisées dans ce but . Les outils que nous allons présenter permettent soit d' apprécier les activités enzymatiques de réparation , soit le niveau d' ARN ou la quantité de protéine de réparation ( Figure 12 ) . Pour finir il faut garder à l' esprit que cette présentation n' est pas exhaustive , et que d' autres outils de mesure existent . Figure 12 : Les différents niveaux d' étude de la réparation de l' ADN A . Etude de la réparation : mesure des activités enzymatiques 1 . Méthodes indirectes basées sur la mesure des lésions Les tests que nous allons présenter dans cette partie permettent de quantifier les lésions présentes dans l' ADN . En observant la disparition des lésions , il est possible lors de cinétique de réparation de mesurer de manière indirecte les activités enzymatiques de réparation . a ) La méthode COMET Principe : La méthode COMET a été décrite pour la première fois en 1984 par O. Ostling et K.J . Johanson . Depuis elle a énormément été utilisée dans de nombreux laboratoires dans le monde , son faible coût et sa simplicité la rendant attrayante . La méthode des comètes est basée sur l' électrophorèse de l' ADN de cellules isolées dans un gel . Elle permet de mesurer les cassures double et simple brin ainsi que les sites alcali-labiles . Son principe est de faire migrer l' ADN nucléaire des cellules dans un gel en milieu alcalin et dénaturant ; si des cassures de la double hélice sont présentes , alors la forme super enroulée de l' ADN sera partiellement désorganisée . Grâce à la force exercée par le champ électrique , on aura migration de boucles d' ADN dans le gel . La visualisation de l' ADN au microscope à fluorescence est réalisée aprés un marquage avec un agent intercalent fluorescent ( ex : bromure d' éthidium ) . S' il y a eu des cassures , il y a apparition d' une forme de comète dont la tête est composée du noyau et la queue de l' expansion des boucles d' ADN dans le gel . La taille et l' intensité de la queue de la comète sont directement proportionnelles au nombre de cassures présentes dans l' ADN nucléaire ( Figure 13 ) . Figure 13 : Observation de comètes au microscope . En A les cellules n' ont pas été stressées , le noyau est parfaitement rond . En B et C les moyaux cellulaires présentent des cassures dues à un stress plus important , une forme de comète apparaît alors . Il est important de noter que la méthode COMET permet aussi de mesurer les dommages qui ne sont pas de cassures de l' ADN , grâce à l' utilisation d' ADN N-glycosylases N-glycosylases spécifiques des lésions étudiées . En effet une incubation des noyaux avec l' ADN N-glycosylase N-glycosylase conduit à la formation de sites abasiques en lieu et place des dommages . Ces sites abasiques seront alors , grâce aux conditions spécifiques du tampon , transformés en cassures simple brin . Plusieurs méthodes permettent d' appréhender les activités de réparation de l' ADN avec la technique COMET : La première méthode permet de mesurer l' activité de réparation de l' ADN in cellulo . Elle consiste tout d' abord à traiter les cellules avec un agent créant des dommages de l' ADN . Les cellules sont ensuite incubées pendant différents temps afin que la réparation de leur ADN puisse se dérouler . Enfin , le test COMET est réalisé . Si une activité de réparation de l' ADN a eu lieu lors de la période d' incubation , alors la taille des comètes s' en trouve réduite , et ce en fonction du temps laissé aux cellules pour réparer leur ADN . La deuxième méthode permet une mesure in vitro des capacités de réparation d' un extrait nucléaire . Elle consiste à traiter les cellules avec un agent créant des dommages de l' ADN , puis à incuber les noyaux cellulaires avec des extraits nucléaires avant de réaliser l' étape de migration par électrophorèse . Pendant l' étape d' incubation avec les extraits nucléaires , les enzymes de réparation peuvent réparer les dommages présents dans l' ADN . Durant cette réparation des incisions de la double hélice vont avoir lieu , on aura alors après migration dans le gel , une apparition de forme de comète . Avantages et inconvénients de la méthode COMET : Les avantages de cette méthode sont qu' elle est simple , très sensible et peu coûteuse , elle peut facilement être mise en place dans un laboratoire possédant un microscope . Une mesure de la réparation de l' ADN in cellulo est possible , ce qui permet de se rapprocher des conditions physiologiques . Enfin cette technique permet de mesurer les activités de plusieurs systèmes de réparation ( recombinaison non homologue , REB , REN ) Les inconvénients résident tout d' abord dans le fait que cette méthode ne permet pas une mesure quantitative et spécifique de la réparation d' un dommage donné , l' ADN N-glycosylase N-glycosylase utilisée pour former les sites abasiques pouvant être spécifique de plusieurs dommages . De plus , cette technique est longue , notamment la phase d' analyse des comètes , et ne permet pas de réaliser des expériences en haut débit . b ) L' élution alcaline Principe : L' élution alcaline est une technique proche de la méthode COMET car elle permet de mesurer les cassures simple brin , double brin et les sites alcali-labiles en utilisant les caractéristiques d' élution de l' ADN . Son principe est de lyser les cellules à l' aide d' un tampon et de les déposer sur un filtre . La plupart du contenu cellulaire , excepté l' ADN , est éliminé par gravité . L' ADN va ensuite être élué à l' aide d' une solution alcaline qui est délivrée grâce à l' action d' une pompe . L' éluant est collecté sous forme de fractions . Les fragments d' ADN court sont élués les premiers alors que les fragments de grande taille sont élués en derniers . La quantité d' ADN de chaque fraction est alors quantifiée . Cette technique a permis d' étudier la réparation de différents dommages : bases alkylées , cassures double brin , adduits cisplatine , dommages oxydatifs . Avantages et inconvénients : Cette méthode non quantitative partage les avantages et inconvénients de la méthode COMET . Toutefois bien que l' élution alcaline soit d' une grande sensibilité , des facteurs extrinsèques tels que le pH de lyse la composition des tampons peuvent influer sur les résultats . c ) La Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à la Spectrométrie de Masse en mode tandem ( CLHP-SM / SM ) Principe : La CLHP-SM / SM est une technique d' analyse quantitative qui permet de détecter spécifiquement un ion en fonction de son rapport masse / charge . Cette méthode est utilisée pour quantifier les dommages présents dans de l' ADN . Le principe est de digérer l' échantillon d' ADN en nucléosides qui vont tout d' abord être séparés par Chromatographie Liquide Haute Performance ( CLHP ) . Les nucléosides sont ensuite ionisés à l' entrée du spectromètre de masse , puis le nucléoside d' intérêt est fragmenté en ions fils , seul un des ions fils sera alors quantifié ( pour plus de détails se reporter à la partie matériels et méthodes ) . C' est la double sélection , de l' ion du nucléosides d' intérêt puis de l' ion fils qui procure à cette technique toute sa spécificité . Cette méthode est particuliérement utilisée au sein de notre laboratoire . Des études ont notamment porté sur les cinétiques de réparation de photoproduits dans les fibroblastes et les kératinocytes . Avantages et inconvénients : Les deux principaux avantages de cette technique sont sa grande spécificité et sa grande sensibilité et le fait qu' elle soit quantitative . La limite de détection est de l' ordre de 1 nucléotide lésé pour 108 nucléotides normaux . Cependant elle possède aussi des inconvénients . Premièrement l' étude de certaines lésions peut poser des problèmes lors , notamment , de la digestion de l' échantillon . En effet , il arrive parfois que des lésions rendent difficile la digestion de l' ADN , ce qui est gênant lors de l' étape d' analyse . Une autre limitation s' applique pour la quantification des bases oxydées , où , dans ce cas précis , il faut porter un grand soin à ne pas réaliser d' oxydation artéfactuelle de l' échantillon . Enfin , pour que l' analyse par CLHP-SM / SM soit quantitative il faut posséder un standard de la lésion afin de calibrer le spectromètre de masse . Il n' est pas toujours aisé de réaliser la synthèse chimique du standard . d ) La PCR médiée par ligation ( PCR-ML ) Principe : Cette technique de PCR permet la cartographie des cassures monocaténaires présentant un phosphate en 5 ' . De ce fait , tout ce qui est présent dans l' ADN et qui peut être converti en cassures monocaténaires peut virtuellement être cartographié par la technique PCR-LM . Selon ce principe , la technique PCR-LM a été également développée pour l' étude de la cartographie et de la réparation des dommages UV induits , tels les DCP , les pp ( 6 - 4 ) , mais aussi les dommages oxydatifs . Nous allons brièvement décrire son principe : les cellules à étudier sont irradiées en UVB afin de former des DCP dans leur génome , l' ADN nucléaire est ensuite récupéré puis mis en présence de T4 endonucléase V qui va spécifiquement couper les DCP et donc former des coupures simple brin . L' ADN est ensuite dénaturé et une PCR asymétrique est réalisée avec une amorce spécifique à la zone génomique à étudier . Un adaptateur est ensuite fixé du côté 3 ' du fragment d' ADN permettant ainsi de réaliser une PCR symétrique . Cette PCR n' a lieu que si un DCP était présent dans la zone génomique d' intérêt , et elle va permettre d' amplifier le fragment d' ADN . Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide est ensuite réalisée , puis les sondes sont électrotransférées sur une membrane de nylon , enfin une autoradiographie est réalisée . Avantages et inconvénients : La PCR-ML permet de mesurer la réparation de DCP , et ce de manière très localisée dans le génome , c' est un avantage qui n' est offert par aucune autre technique . Cette méthode permet donc d' étudier la réparation de « points chauds » de gènes comme p 53 , mais aussi l' effet de la présence de facteurs de transcription sur la formation des dommages dans les promoteurs . Cependant , cette méthode présente l' inconvénient , nous l' avons vu , d' utiliser la radioactivité , et n' est pas facilement utilisable dans le cadre d' expériences réalisées en haut débit . De plus , les étapes de ligation peuvent s' avérer délicates . e ) Les autres techniques D' autres techniques permettant de mesurer la disparition de dommages lors de cinétique de réparation existent . Nous ne les décrirons pas , mais nous pouvons citer notamment l' utilisation d' anticorps spécifiques dirigés contre des lésions , la CLHP couplée à un détecteur éléctrochimique . 2 . Les méthodes de mesure directe des activités enzymatiques de réparation a ) La réactivation de plasmide lésé ( RPL ) Principe : Cette méthode est basée sur la transfection de cellules avec un plasmide codant pour un gène rapporteur , par exemple la luciférase ou LacZ , comportant un dommage . L' expression du gène rapporteur est inactivée par la présence de la lésion et ce de deux manières possibles : soit la présence de la lésion bloque la transcription du gène ( ex : dimères de pyrimidine ) , soit elle induit une mutation dans un codon modifiant ainsi un acide aminé essentiel au bon fonctionnement de la protéine ( ex : diols de thymines ) . L' activité de réparation cellulaire est mesurée au microscope en observant le niveau d' expression du gène rapporteur . Si la cellule n' a pas réussi à réparer la lésion alors l' expression du gène rapporteur est nulle ; au contraire , si la lésion a été correctement réparée alors l' expression du gène rapporteur est présente . ( Figure 14 ) . Figure 14 : Schéma simplifié du principe d' une expérience de réactivation plasmide lésé Cette méthode permet théoriquement d' étudier tous les systèmes de réparation : REB , REN , réparation des mésappariements , O6-MGMT , à partir du moment où la lésion introduite est capable d' inhiber l' expression ou l' activité de la protéine rapportrice . Une variante de ce test a même été développée afin de mesurer la réparation des cassures double brin par les systèmes de réparation par recombinaison . Avantages et inconvénients : Cette méthode offre plusieurs avantages . Tout d' abord celui de maîtriser parfaitement le type de dommage dont on va étudier la réparation , ainsi que sa quantité . En effet , l' introduction de la lésion dans la séquence d' ADN du gène rapporteur est réalisée par synthèse chimique , seul le type de dommage désiré sera donc présent . De plus la synthèse chimique offre l' autre avantage de choisir précisément le nombre de dommages introduits , et par conséquent permet de réaliser des sites multi-lésés , mais aussi d' introduire la lésion dans le brin transcrit ou non transcrit afin d' étudier la réparation couplée à la transcription . Enfin la RPL présente l' avantage de permettre la mesure des activités de réparation de pratiquement tous les systèmes de réparation et ce in cellulo . Le principal inconvénient de cette méthode est qu' elle nécessite la transféction de cellules , or toutes les cellules ne sont pas facilement transfectables . Se rajoute à cela le fait que la transfection n' est pas un événement neutre pour la cellule et qu' il peut modifier sa physiologie et donc biaiser la réponse observée . b ) La synthèse d' ADN non programmée ( SANP ) ou Unscheduled DNA synthesis ( UDS ) Principe : Cette technique a pour but de mesurer la resynthèse d' ADN qui a lieu lors de REN . Elle n' a jamais été utilisée pour mesurer l' étape de resynthèse de la REB bien que cela soit théoriquement possible . Le principe de cette méthode a été décrit par A. Lehmann et S. Stevens dans un article publié en 1980 . Il s' agit en premier lieu de traiter les cellules de telle façon qu' elles n' effectuent plus de synthèse d' ADN . Pour ce faire , les cellules sont cultivées à confluence dans un milieu dépourvu d' arginine , afin de limiter les divisions , puis elles sont traitées avec de l' hydroxyurée . Ce composé est un inhibiteur de la ribonucléotide diphosphate réductase , enzyme responsable de la formation de désoxynucléotides triphosphates à partir de ribonucléotides diphosphates . La concentration de désoxynucléotides triphosphates cellulaires se retrouve alors fortement réduite , empêchant la réplication d' avoir lieu . Cependant , il est important de noter que ce niveau faible en désoxynucléotides triphosphates n' empêche pas la synthèse d' ADN lors de la réparation . Les cellules sont alors traitées afin de former des dommages dans leur ADN . Le traitement le plus couramment utilisé pour étudier la REN est une exposition aux UVB . Ensuite les cellules sont mises en présence de thymidine tritiée qui sera incorporée durant l' étape de resynthèse de la REN . Les cellules sont ensuite lavées afin d' éliminer la thymidine tritiée non incorporée , puis une autoradiographie est réalisée . La quantification de la réparation se fait enfin en comptant le nombre de points présents dans chaque noyau correspondant aux foyers de resynthèse ( Figure 15 ) . Figure 15 : Image obtenue après autoradiographie lors d' une expérience de synthèse d' ADN non programmée réalisée sur des cellules HeLa . En A , sur les cellules contrôles , on observe que les quelques cellules en phase S ont fortement incorporées de la thymidine tritiée , mais que les cellules en G1 ne possèdent pas de foyers de réparation . En B les cellules ont été irradiées en UV à 10 J / m& 194;& 178; , on observe la présence d' un grand nombre de foyers de réparation ( petits points noirs ) . Enfin il est à noter que cette technique est utilisée en France à l' Institut Gustave Roussy pour le diagnostic des personnes atteintes de Xeroderma pigmentosum pigmentosum et qu' un autre test découlant de cette méthode permet de mesurer la reprise de la synthèse d' ARN . Son principe est globalement similaire à celui de la SANP , excepté qu' il s' agit dans ce cas de mesurer l' incorporation d' uridine marquée radioactivement dans l' ARN . Cette méthode , quant à elle , est utilisée pour le diagnostic des personnes atteintes du syndrome de Cockayne . Avantages et inconvénients : Le principal avantage de la synthèse d' ADN non programmée est qu' elle permet de mesurer , tout comme la méthode COMET et la RHC , la réparation in cellulo . Cette technique a malheureusement beaucoup d' inconvénients . Le premier est l' utilisation de la radioactivité comme moyen de détection , qui rend lourde la mise en place d' expériences . De plus , le temps de l' expérience est très long et dure quinze jours et n' est absolument pas adapté à du haut débit . Enfin , le traitement appliqué aux cellules pour inhiber la resynthèse d' ADN non liée à la réparation peut être considéré comme un stress important qui peut fortement agir sur la réponse cellulaire observée . Enfin , les écarts types obtenus avec cette technique sont très importants , aussi si l' on veut caractériser un fibroblaste de patient XP il faut que la diminution de réparation par rapport au témoin soit au moins de 50 % . c ) Test in vitro d' excision resynthèse Principe : Le premier test in vitro permettant de mesurer l' activité de REN d' extraits cellulaires nucléaires a été décrit par R. Wood en 1988 . Cette méthode tire profit , tout comme la méthode de SANP , de l' étape de resynthèse d' ADN lors de REN pour incorporer , dans un plasmide comportant une lésion , un nucléotide marqué radioactivement . Les plasmides sont ensuite précipités , puis une électrophorèse sur gel d' agarose est réalisée suivie d' une autoradiographie afin de mesurer la quantité de radioactivité incorporée lors de la réparation des plasmides . La lésion portée par le plasmide peut être introduite de différentes manières , soit en incorporant dans le plasmide un oligonucléotide de synthèse comportant une ou plusieurs lésions , soit en traitant les plasmides chimiquement ou avec un rayonnement . Dans le second cas , la position et le nombre de lésions par plasmide sont plus délicats à contrôler . Ce test peut aussi être réalisé en utilisant un dNTP marqué à la digoxigénine , la quantification se faisant alors par colorimétrie en utilisant des anticorps couplés à la phosphatase alkaline Enfin , G.L . Dianov a montré que cette méthode est aussi utilisable pour mesurer la réparation par excision de base , en tirant là aussi parti de l' étape de resynthèse d' ADN . Avantages et inconvénients : Ce test présente l' avantage d' être particulièrement sensible , aussi bien lorsqu' il est utilisé avec un marquage radioactif que colorimétrique , mais l' utilisation de la radioactivité peut être aussi considérée comme un inconvénient . Enfin , un autre inconvénient de ce test est qu' il ne donne pas accès à une mesure in cellulo de la réparation . d ) Test in vitro d' excision Principe Le test in vitro d' excision permet de mesurer principalement les activités glycosylases de la REB . Son principe est tout d' abord de marquer radioactivement à une de ses extrémités , un oligonucléotide double brin portant une lésion . L' oligonucléotide est ensuite incubé avec des enzymes de réparation purifiées ou des extraits cellulaires . Si au cours de cette étape une excision a lieu , alors l' oligonucléotide portant la lésion sera coupé en deux . On fait ensuite migrer sur gel d' acrylamide dénaturant l' oligonucléotide , puis une autoradiographie du gel est réalisée . Si une excision a eu lieu , deux bandes distinctes seront observées , une correspondant à l' oligonucléotide portant la lésion non excisée , et l' autre correspondant au fragment d' oligonucléotide formé lors de l' excision . Il est alors possible de calculer des rendements réactionnels en quantifiant la radioactivité présente dans chaque bande , ou de réaliser des cinétiques de réparation . Avantages et inconvénients : Cette méthode offre plusieurs avantages . Premièrement , elle est très sensible car elle utilise la radioactivité . De plus , l' emploi d' oligonucléotides de synthèse permet de maitriser parfaitement le nombre de lésions , mais aussi de réaliser des sites multilésés . Enfin , le fait que l' on puisse déterminer le rendement réactionnel , en connaissant à la fois la quantité d' oligonucléotide excisé et non excisé , permet le calcul de constantes biochimiques . Cependant cette technique présente comme inconvénient majeur d' utiliser la radioactivité . 3 . Conclusion Toutes les méthodes que nous venons de décrire présentent l' avantage de permettre une mesure des activités enzymatiques de réparation de l' ADN . Mais elles partagent aussi pour certaines des inconvénients majeurs comme l' utilisation de la radioactivité , ou bien encore un temps de réalisation très long . Parfois même certaines méthodes combinent les deux . Aucune d' entre elles ne permet de réaliser la mesure de la réparation de plusieurs dommages en une seule réaction et ce de manière spécifique , elles ne permettent donc pas de réaliser des expériences en haut débit . Les techniques que nous allons aborder maintenant présentent elles l' avantage de mesurer plusieurs paramètres en une seule réaction , cependant elles ne permettent pas une mesure directe des activités de réparation . B . Mesure de la réparation : les biopuces Nous venons de voir les outils de mesure de la réparation , basés sur la fonctionnalité enzymatique . Ici nous allons aborder deux techniques permettant une étude de la réparation , fondée soit sur la mesure du niveau d' expression d' ARNm avec les biopuces à ADNc , soit sur la mesure de la quantité de protéine avec les biopuces à anticorps . Ces deux méthodes tirent profit des récentes avancées technologiques dans différents domaines tels que l' imagerie , les molécules fluorescentes , l' automatisation , et la dispense de liquide à faibles volumes . La haute densité des dépôts présents sur les biopuces permet de diminuer le volume nécessaire pour réaliser le test , et surtout de mesurer un grand nombre de paramètres en une seule réaction . Tous ces facteurs font des biopuces un outil particulièrement puissant . 1 . L' étude du transcriptome au moyen de biopuces a ) Principe et méthode L' utilisation de cette méthode permet d' étudier le niveau d' expression des gènes , et part du postulat que le niveau d' expression des ARNm reflète la quantité de protéines présentes dans la cellule et donc les capacités de réparation . Plusieurs articles relatent l' utilisation de cette technique pour étudier l' expression des transcrits impliqués dans différents systèmes de réparation de l' ADN : REN , RNH , O6-MGMT , réparation des mésappariements . Bien que très récent , le concept des biopuces à ADN est né en fait il y a 25 ans en 1975 avec l' invention du Southern Blot , où pour la première fois des hybridations d' ADN était réalisées sur une membrane . Il faut attendre 1995 pour voir apparaître le premier article relatant la fabrication et l' utilisation d' une biopuce dédiée à l' étude du transcriptome . Cette technologie est née du désir de pouvoir comparer les niveaux d' expression d' ARNm entre deux échantillons différents en utilisant le fait que deux séquences d' ADN complémentaires peuvent s' hybrider . Les biopuces sont fabriquées en déposant les sondes ADNnc des ARNm d' intérêt sur une lame de verre , ou une membrane de nylon . Les ADNc porteront le nom de cibles lors de l' étape d' hybridation , leur densité peut aller jusqu'à 1000 par cm& 194;& 178;. Le besoin de réaliser des dépôts en haute densité vient en partie de la nécessité d' économiser les échantillons biologiques souvent précieux ; en effet , plus la surface couverte par les dépôts est petite et moins la quantité d' échantillon à mettre en contact est grande . En vue de réaliser le test , les ARNm des deux échantillons cellulaires à comparer sont purifiés ; une amplification par PCR est parfois nécessaire afin de pouvoir détecter les transcrits présents en faible quantité . Ensuite une étape utilisant la transcriptase inverse permet d' obtenir les ADNc des ARNm d' intérêt . Les ADNc des deux échantillons sont alors marqués chacun avec un marqueur fluorescent différent , typiquement Cy 3 qui fluoresce fluoresce dans le vert et Cy 5 qui fluoresce dans le rouge . L' expérience est réalisée en déposant ensemble les ADNc des deux échantillons sur la puce . L' hybridation de chaque ADNc avec sa sonde va alors avoir lieu , cependant il y aura une compétition entre les ADNc des deux échantillons . La biopuce est alors lavée puis lue aux deux longueurs d' ondes des deux marqueurs fluorescents et les deux images obtenues sont superposées . Si la quantité d' ADNc de chaque échantillon qui a réagi avec un dépôt est identique alors le dépôt apparaîtra jaune car il y a autant de fluorescence verte que rouge . Si un ADNc était plus représenté dans un échantillon que dans l' autre alors la couleur du dépôt serait soit rouge ou soit verte ( Figure 16 ) . Des logiciels d' analyse dédiés permettent ensuite de traiter les données générées lors de l' expérience et de mettre en évidence les différences transcriptomiques des deux échantillons . Figure 16 : Schéma du déroulement d' une expérience d' étude du transcriptome sur puce à ADN . b ) Avantages et inconvénients Cette technique est très sensible surtout si une étape d' amplification des ARN est utilisée . De par la haute densité des dépôts , elle permet d' analyser l' expression spécifique de milliers d' ARNm en une seule réaction et dans des volumes de l' ordre de la dizaine de microlitres , ce qui permet de réaliser des expériences en utilisant très peu d' échantillon . Enfin l' approche par hybridation compétitive permet de mettre élégamment en évidence les différences transcriptomiques de deux échantillons . Cependant plusieurs critiques peuvent être émises . Premièrement l' étape de purification et d' amplification des ARNm est très délicate , et les quantités d' ADNc de chaque échantillon déposé sur la puce doivent être parfaitement contrôlées afin de ne pas introduire de biais . Enfin rien ne garantit que le niveau d' expression d' un ARN reflète entièrement le niveau d' expression protéique ainsi que l' activité enzymatique . Plusieurs facteurs comme le niveau de traduction des ARNm , la durée de leur demi-vie peuvent agir sur la quantité de protéine et ne sont pas pris en compte . De plus , beaucoup de modifications postraductionelles peuvent influer sur l' activité d' une protéine ( glycosylation , SUMOylation , phosphorylation , ubiquitination ) . Le niveau d' expression d' ARNm est un indicateur intéressant , mais il ne peut en aucun cas se substituer à un test fonctionnel . 2 . Les puces à anticorps a ) Principe des puces à anticorps Les biopuces à anticorps sont une évolution récente des puces à ADN , elle ont vu le jour en tirant profit des avancées technologiques acquises lors de la mise au point des biopuces à ADN . Le premier article présentant une biopuce à protéine est paru en 2000 , ce qui fait que cette technologie est très jeune et très peu d' articles relatent son utilisation pour étudier la réparation de l' ADN . On peut toutefois noter que le niveau d' expression des protéines de la NER a été mesuré par cette technique dans des lymphocytes pour diagnostiquer une prédisposition au cancer de la tête et du cou à cellules squameuses , mais aussi pour mesurer le niveau des protéines de la RNH durant une ischémie . Les biopuces à anticorps sont fabriquées en déposant des anticorps sur une lame de verre exactement de la même manière dont sont fabriquées les biopuces à ADN . Elles permettent de mesurer la quantité de protéines présentes dans un échantillon , en tirant profit de la grande spécificité de fixation des anticorps pour leur antigène , ici les protéines d' intérêt . Le déroulement d' une expérience réalisée avec une biopuce à anticorps est pratiquement identique à celui des biopuces à ADN . Les protéines de deux échantillons sont extraites , puis marquées avec soit du Cy 3 soit du Cy 5 . Les deux échantillons sont ensuite déposés sur la puce à anticorps en quantité égale . Une compétition s' opère alors entre les protéines des deux échantillons pour se fixer sur l' anticorps spécifique de ces dernières . L' analyse conduit là aussi à la superposition de deux images obtenues après lecture , ces deux images correspondant à la fixation des protéines de chaque échantillon . Tout comme pour les puces à ADN , la couleur indique le niveau de fixation des protéines ( Figure 17 ) . b ) Les avantages et inconvénients des puces à anticorps Cette technique est très sensible . Elle possède les mêmes avantages que les biopuces à ADN quant au très grand nombre de paramètres testés , ainsi que le faible volume d' échantillon nécessaire pour réaliser l' expérience . Cette méthode est aussi très spécifique , on sait exactement quelle protéine est présente , contrairement aux tests de fonctionnalité où l' on peut observer une augmentation de la réparation sans savoir quelle protéine a pu intervenir . Cette méthode a plusieurs inconvénients . Tout d' abord les puces à anticorps sont coûteuses , car les anticorps étant souvent vendus très cher , une puce de plusieurs milliers de dépôts d' anticorps n' est pour le moment pas réalisable . La nombre de dépôts sur ces biopuces reste pour le moment assez faible , ce qui pour certaines applications n' est pas forcement gênant . Enfin on ne mesure pas d' activité de réparation , mais la quantité de protéine , or ceci ne justifie pas forcement leur activité . Les modifications postraductionelles peuvent moduler cette activité , tout comme l' épissage alternatif des ARN . Figure 17 : Schéma du déroulement d' une expérience d' étude du protéome sur puce à protéines . C . Conclusion sur les outils permettant d' étudier la réparation Comme nous venons de le voir , deux types de test existent . D' un côté nous avons les tests qui permettent une mesure des activités de réparation qui ont pour avantage d' appréhender le niveau de réparation de l' échantillon , mais ces tests sont souvent longs , ou nécessitent l' utilisation de matières radioactives . D' un autre côté nous avons les outils permettant de mesurer la quantité d' ARNm ou de protéine de l' échantillon afin d' estimer les capacités de réparation de l' ADN . Ces tests sont très spécifiques et ont l' avantage d' utiliser le format de biopuce qui permet de mesurer un grand nombre de paramètres en utilisant une très faible quantité d' échantillon . Cependant ils ne permettent pas d' appréhender directement le niveau d' activité de réparation . Le Tableau 6 compare les différentes caractéristiques des outils d' étude de la réparation que nous avons présentés . Au vu de ces données , un test utilisant le format biopuce et permettant de mesurer les activités de réparation de manière spécifique combinerait les avantages des deux mondes et pourrait être un outil très puissant . Tableau 6 : Comparaison des différents outils utilisés pour l' étude de la réparation de l' ADN . Objectifs de la thèse Objectifs de la thèse Depuis la découverte dans les années 60 par R . E . Rasmussen et R . B . Painter , chez l' Homme , de la réparation par excision de nucléotides , les recherches dans le domaine de la réparation de l' ADN ce sont intenssifiées . Les chercheurs ont en effet compris très tôt l' importance et l' implication des mécanismes de réparation dans le processus de carcinogenèse ainsi que dans les maladies génétiques comme Xeroderma pigmentosum pigmentosum , et le Syndrome de Cockayne . Les recherches ont par la suite conduit à la découverte d' autres systèmes de réparation tels que la réparation par excision de base , le système de réparation des mésappariements ou les systèmes de réparation des cassures de l' ADN . Aujourd'hui la compréhension de ces mécanismes est approfondie chaque jour un peu plus , et l' existence d' interactions et de complémentarités entre les différents systèmes de réparation ont récemment été montrées . Cependant les tests fonctionnels dont on dispose pour étudier les mécanismes de réparation ne prennent pas en compte toute cette complexité . En effet , le plus souvent , ils sont basés sur la mesure de la réparation d' une seule lésion par un seul système de réparation . D' un autre côté , l' utilisation récente de biopuces à ADN et à anticorps permet grâce à leur format , d' appréhender cette complexité mais de manière indirecte en ne donnant pas d' indication sur les activités enzymatiques de réparation . Le premier objectif de cette thèse était , en partant du constat précédant , de mettre au point un outil miniaturisé d' étude des systèmes de réparation de l' ADN , offrant une mesure parallélisée , fonctionnelle et spécifique de la réparation de plusieurs dommages . Pour ce faire , nous avons décidé d' adapter le test fonctionnel d' excision resynthèse décrit par R. Wood au format biopuce qui permet de faire des mesures parallélisées tout en utilisant de faibles volumes réactionnels . Par la suite , nous devions nous assurer de la validité du test . Dans ce but , nous avons réalisé des expériences permettant de montrer que les signaux mesurés correspondent bien , et ce de manière spécifique , à une activité de réparation de l' ADN . Enfin , une fois que cette étape de validation a été acquise , nous nous sommes proposé de réaliser deux expériences applicatives dans le but de démontrer l' utilité pratique de cette biopuce et ce dans deux domaines différents . La partie expérimentale qui suit est découpée en cinq chapitres . Nous présenterons dans le chapitre I la mise au point de la fabrication de la biopuce , à travers le choix des lésions , le réglage du robot de dispense , et le choix du support . Dans le chapitre II sera abordé la méthode de quantification , ainsi que la mise au point de l' outil bioinformatique développé spécifiquement pour normaliser les données générées lors du test . Seront aussi présentés les outils que nous utilisons pour analyser les résultats . Le chapitre III sera consacré à la mise au point du test biologique , à savoir les conditions de réaction , mais aussi les différentes méthodes de préparation d' extraits cellulaires et les avantages et inconvénients de chacune d' entre elles . Dans le chapitre IV nous exposerons les différentes expériences qui ont été réalisées afin de valider la spécificité du test . Pour finir , dans le chapitre V seront présentées deux expériences montrant des applications possibles de ce test . La première est la mesure des activités de réparation dans différents types cellulaires humains issus de cultures primaires , kératinocytes , fibroblastes , ou prélevées directement sur le donneur : cellules mononuclées du sang périphérique . La seconde expérience applicative que nous avons réalisée porte sur l' irradiation de cellules lymphoblastiques par des rayons gamma , ceci afin d' étudier la régulation des systèmes de réparation et notamment la réponse adaptative cellulaire . Partie expérimentale Introduction à la partie expérimentale Le test que nous nous sommes proposé de mettre au point devait posséder les avantages d' un test fonctionnel de mesure de la réparation , ainsi que ceux procurés par le format biopuce . Nous avons donc décidé de transposer le test d' excision resynthèse décrit par R. Wood au format biopuce . Le test d' excision resynthèse , que nous avons présenté dans le chapitre dédié aux outils de mesure de la réparation , tire profit de l' étape de resynthèse présente dans plusieurs systèmes de réparation ( REB , REN , RH ) pour incorporer dans le brin d' ADN réparé un nucléotide marqué . Si la lésion est réparée , alors il y a incorporation de nucléotides marqués , et donc apparition de signal ( Figure 18 ) . Le test d' excision resynthèse décrit par R. Wood est typiquement réalisé dans un tube comportant l' extrait cellulaire à tester en présence d' ADN lésé et du nucléotide marqué . Comme nous voulions une mesure parallélisée de la réparation de plusieurs dommages , nous avons utilisé le format biopuce . Nous avons donc réalisé des dépôts d' ADN sur support , chaque dépôt d' ADN comportant un dommage spécifique . La réaction du test a alors lieu en faisant réagir les extraits cellulaires d' intérêt sur la biopuce en présence de nucléotide marqué . Dans notre cas , et pour des questions pratiques , nous avons décidé d' utiliser un nucléotide marqué avec une molécule fluorescente de type Cy 5 ou Cy 3 . L' utilisation de marqueur fluorescent nous a permis de bénéficier de tous les outils de lecture et d' analyse déjà existants développés pour les biopuces à ADN et à protéines . Afin d' avoir une vue d' ensemble du test , un schéma organisationnel est présenté sur la Figure 19 . Figure 18 : Schéma explicatif du principe du test que nous avons développé . Figure 19 : Digramme organisationnel des différentes étapes nécessaires à la réalisation du test . Chapitre I : Mise au point de la fabrication de la biopuce Introduction Dans ce chapitre , nous allons traiter de la mise au point de la fabrication de la biopuce . Cela comprend plusieurs étapes . Tout d' abord nous présenterons les ADN lésés que nous avons choisi de déposer sur la biopuce , ainsi que les réactions utilisées pour les former . Dans une seconde partie nous aborderons comment ont été réalisées les dépôts d' ADN comportant les lésions , seront présentées toutes les étapes de mise au point du robot de . Enfin une dernière partie traitera des lames supports sur lesquelles ont été réalisées les dépôts . Les étapes qui vont être abordées dans ce chapitre sont présentées sur la Figure 20 . Figure 20 : Digramme organisationnel des différentes étapes nécessaires à la réalisation du test . Les étapes entourées en bleu seront traitées dans ce chapitre . I. Les différentes lésions présentes sur la biopuce A . L' ADN portant les lésions Le choix du type d' ADN portant les lésions est important . Dans notre cas , nous avons choisi le même que celui qui est couramment utilisé lors des tests d' excision resynthèse , à savoir de l' ADN plasmidique . Cette conformation particulière de l' ADN possède plusieurs avantages non négligeables . Premièrement , étant sous forme circulaire , l' ADN plasmidique ne présente pas de bouts francs qui sont le substrat de réactions capables , en provoquant un signal non spécifique , de perturber la mesure des activités de réparation de l' ADN . De plus , les plasmides offrent aussi la particularité de pouvoir être super enroulés , qui est un meilleur substrat pour les enzymes de réparation que l' ADN linéaire . Enfin , les bactéries ont la capacité d' amplifier de manière très rapide les plasmides ce qui rend leur production très aisée et peu coûteuse . B . Préparation des plasmides portant les lésions 1 . La qualité des plasmides Les plasmides peuvent perdre leur forme super enroulée notamment si une coupure simple brin est induite . L' apparition de ces cassures simple brin peut être spontanée , mais elles apparaissent principalement lors de certains traitements utilisés pour former les lésions . La présence de ces coupures peut conduire à des réactions non spécifiques . Nous avons donc apporté un grand soin à maintenir les plasmides dans leur conformation super enroulée car elle est garante de l' intégrité de leur structure , et nous assure que les réactions de réparation auront lieu sur une population homogène de plasmides . Pour cela , nous avons tout d' abord effectué un contrôle qualité en réalisant une électrophorèse sur gels d' agarose des plasmides lésés . Cette étape permet de s' assurer de leur bonne conformation , à savoir s' ils étaient sous forme linéaire , circulaire , ou circulaire super enroulée . Dans le cas où les plasmides présentaient trop de cassures , notamment après avoir subi le traitement permettant de former les lésions , nous avons réalisé des purifications par ultracentrifugations sur gradient de sucrose . Cette technique nous a permis de séparer les plasmides en fonction de leur conformation spatiale et ainsi de purifier spécifiquement ceux sous forme super enroulée . 2 . La qualité des lésions La qualité des lésions est un facteur très important , nous devions nous assurer du nombre de lésions par plasmide et du type de lésions présentes . En effet , si un traitement forme en plus de la lésion attendue d' autres types de dommages , cela fait perdre toute spécificité au test . C' est pour cela qu' à chaque fois que cela était possible , un dosage des lésions par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en mode tandem ( CLHP-SM / SM ) a été réalisé au laboratoire par Thierry Douki et Jean-Luc Ravanat . Le nombre de dommages par plasmide a ainsi pu être calculé grâce à l' utilisation de solution standard permettant de calibrer le spectromètre de masse . Pour certaines lésions nous n' avions pas de standard et nous n' avons donc pas pu réaliser cette quantification . 3 . Choix du nombre de lésions par plasmide Le choix de la quantité de dommages par plasmide a été déterminé de manière empirique en réalisant des expériences de mesure de la réparation d' extraits nucléaires HeLa commerciaux qui nous ont servi de standard . Lors de ces expériences , nous avons ajusté la quantité de dommages de chaque plasmide afin d' avoir un signal de réparation équilibré entre les différentes lésions . Nous ne voulions pas que le niveau de réparation très élevé d' un dommage masque le niveau de réparation plus faible d' un autre dommage . Nous avons cependant rencontré des problèmes avec les dommages formés par le cisplatine et le psoralène . En effet le niveau de réparation des lésions formées par ces deux composés était très faible . Pour ces deux types de dommage , nous avons arbitrairement pris le choix d' utiliser les conditions de traitement générant un pourcentage de cassures inférieur à 10 % . C . Les différents plasmides présents sur la biopuce Nous avions pour ambition de pouvoir mesurer les activités de réparation de plusieurs systèmes de réparation , par conséquent , nous avons décidé de couvrir un large spectre de dommages allant des petites lésions de bases aux pontages inter et intra-brin en passant par les lésions UV induites . Pour cela nous avons traité des plasmides afin de produire le plus spécifiquement possible chaque lésion . 1 . Plasmide contrôle Afin de pouvoir mesurer le niveau des activités enzymatiques non spécifiques lors du test , nous avons déposé sur la biopuce un plasmide ne comportant pas de lésions : pControl . Ce plasmide sert aussi de référence lors du dosage CLHP-SM / SM des lésions afin de vérifier l' efficacité des traitements utilisés pour former les différents dommages . 2 . Plasmide portant les dimères de cyclobutane de pyrimidine et les photoproduits ( 6 - 4 ) Les bases de l' ADN présentent la particularité d' absorber le rayonnement UV , principalement aux longueurs d' onde des UVC et des UVB . Cette absorption d' énergie peut conduire à la formation des DCP et des pp ( 6 - 4 ) qui sont des pontages entre les bases pyrimidiques ( Figure 21 ) . Figure 21 : Exemples de DCP : Thymine Thymine et de pp ( 6 - 4 ) : Thymine Thymine Il semblait intéressant que ces dommages soient présents sur la biopuce . En effet leur réparation est particulièrement étudiée , premièrement parce qu' ils sont formés par le rayonnement UV auquel nous sommes tous exposés , mais aussi car ils sont responsables de cancers cutanés . Enfin ces lésions sont typiquement prises en charge par le système de réparation par excision de nucléotides , donc la réparation peut être mesurée à l' aide de notre test . Nous avons choisi de former les DCP et les pp ( 6 - 4 ) en irradiant les plasmides avec une lampe UVC . Cette méthode permet de générer rapidement et facilement ces lésions , cependant elle ne permet pas de former spécifiquement les DCP ou lespp ( 6 - 4 ) . Les plasmides comportent donc un mélange des deux lésions . Lors du dosage des lésions par CLHP-SM / SM , nous avons observé , tardivement , que de la 8- oxoG était aussi formée . Aussi quelques expériences de cette étude ont été réalisées sur des biopuces dont le plasmide , portant les lésions DCP et les pp ( 6 - 4 ) , a été obtenu par cette méthode , il est nommé pCPD- 64 * . Par la suite , nous avons pu diminuer fortement la quantité de 8- oxoG formée en irradiant les plasmides en solution congelée , ce qui permet de bloquer le déplacement des espèces réactives de l' oxygène responsables de la formation de la 8- oxoG ( Tableau 7 ) . Ce plasmide est nommé pCPD- 64 . Tableau 7 : Nombre de lésions pp ( 6 - 4 ) , DCP , 8- oxoG par plasmide ( 3000 pb ) , pControl , pCDP- 64 * et pCPD- 64 3 . Les plasmides portant des produits d' oxydation de bases Le métabolisme de nos cellules , qui a lieu dans les mitochondries , est basé sur l' utilisation d' oxygène , et génère de manière endogène des espèces réactives de l' oxygène : peroxyde d' hydrogène , radical hydroxyle . Ces molécules électrophiles sont très réactives et peuvent réagir avec de nombreux composés cellulaires dont l' ADN . L' oxydation des bases conduit à la formation de toute une famille de lésions dont deux sont particulièrement étudiées : la 8- oxoG et les diols de thymines . a ) Plasmide portant la 8- oxoG La 8- oxoG est une petite lésion issue de l' oxydation de la guanine . Elle est prise en charge par la réparation par excision de base . Dans un premier temps nous avons réalisé les lésions 8- oxoG en utilisant un endoperoxyde de naphtalène qui agit comme source d' oxygène singulet pour oxyder la Guanine . Cependant , lorsque nous avons réalisé le dosage par CLHP-SM / SM des lésions , nous nous sommes aperçu , de manière tardive , qu' il y avait pratiquement autant de 8- oxoG présente dans le plasmide traité que dans le plasmide contrôle , et que des lésions diols de thymines et HmdU étaient formées ( Tableau 8 ) . Les conditions de ce traitement sont très délicates à mettre au point et , nous pensons que la HmdU mesurée correspondent à des produits de sur-oxydation de la 8- oxoG formée . De plus l' endoperoxyde de naphtalène s' est avéré être instable dans le temps ce qui a rendu son utilisation compliquée . Quelques expériences de cette étude ont été réalisées sur des biopuces dont le plasmide portant la lésion 8- oxoG a été obtenu par cette méthode . Dans ce cas précis il est nommé p 8 oxo * . Fort de ce constat , nous avons alors décidé de former la 8- oxoG par une autre voie . Nous avons alors utilisé la riboflavine , cette molécule est un photosensibilisateur qui est activé par la lumière visible . Une fois activée , elle a la capacité d' oxyder les bases de l' ADN en produisant de manière majoritaire de la 8- oxoG ( Figure 22 ) . Figure 22 : Formation de la 8- oxoG par l' oxydation de la guanine par la riboflavine Avec le dosage des lésions , nous avons pu nous assurer que le traitement à la riboflavine , contrairement à celui utilisant de l' endoperoxyde de naphtalène , ne formait pas d' autres dommages oxydatifs , notamment ceux de la thymine ( Tableau 8 ) . Le plasmide portant la lésion 8- oxoG obtenue par le traitement à la riboflavine est nommé p 8 oxo . Tableau 8 : Nombre de lésions de 8- oxoG , diols de thymines et hmdU par plasmide p 8 oxo b ) Plasmides portant les diols de thymines Les diols de thymines sont des petites lésions issues de l' oxydation de la thymine . Elles existent sous quatre formes isomères , deux sous la forme cis et deux sous la forme trans . Tout comme la 8- oxoG , elles sont réparées par la REB . Nous avons appelé le plasmide comportant les diols de thymines pThymG . Pour produire ces lésions , nous avons utilisé un traitement à base de KMNO4 qui permet d' oxyder spécifiquement la thymine et plus faiblement les cytosines . Lors de la réaction , Mn 2 + réagit avec la double liaison carbone carbone des pyrimidines pour former les diols de thymines ( Figure 23 ) . Figure 23 : Réaction de formation des diols de thymines à partir de l' oxydation de la thymine par le permanganate , des cétones peuvent aussi être formés selon les conditions mais ne sont pas le produit majoritaire de la réaction . Le dosage des lésions par CLHP-SM / SM a permis de montrer que le traitement au permanganate permettait de produire spécifiquement des diols de thymines ; en effet , bien qu' étant un produit d' oxydation de la thymine , nous n' avons pas pu mesurer de hmdU. De plus , nous n' avons pas pu mettre en évidence non plus d' oxydation de la guanine . Il est important de noter toutefois que nous n' avons pas mesuré les diols de cytosines qui sont aussi produits au cours de cette réaction . De plus leur dégradation conduit à la formation de 5 OHdC et de diols d' uridine . Il ne faut donc pas négliger la présence de ces lésions ( Tableau 9 ) . Tableau 9 : Nombre de lésions de diols de thymines , 8- oxoG et hmdU par plasmide pThymG 4 . Plasmide portant des bases alkylées L' alkylation des bases , ou l' ajout d' une chaine alkylée , est un phénomène qui a lieu naturellement dans les cellules , notamment à travers les méthylations de bases , mais ce n' est pas le seul mécanisme . En effet , les lipides de la membrane cellulaire , tout comme l' ADN , subissent quotidiennement des oxydations par les ERO . Cette oxydation porte le nom de peroxydation lipidique et peut conduire à la formation d' aldéhydes tels que le 4-HNE et le DDE qui ont la particularité d' être très réactifs et de pouvoir réagir avec les bases de l' ADN . Ces réactions conduisent , entre autres , à la formation de bases modifiées , présentant un adduit exocyclique éthéno possédant ou non une chaîne alkylée ( Figure 24 ) . La réparation de ces dommages est attribuée à la REB , des glycosylases étant spécifiques de ce type d' adduit . Cependant , on peut penser que si l' adduit est de grande taille ( présence d' une chaîne alkylée ) , la REN pourrait alors intervenir . Figure 24 : Réaction de formation de l' éthénoGuanine grace à la réction de DDE sur la guanine . Le plasmide présent sur la biopuce et comportant ces bases alkylées est nommé pAlkB. Pour former les bases alkylées ayant un adduit exocyclique , nous avons utilisé le DDE . Lors du dosage des lésions par CLHP-SM / SM , nous avons quantifié uniquement les adduits éthéno de la guanine et de l' adénine ne présentant pas de chaîne alkylée . Comme nous pouvons le constater , le DDE forme majoritairement de l' EthénoGuanine et très peu d' EthénoAdénine , néanmoins il a aussi la particularité de former quelques diols de thymines ( Tableau 10 ) . Tableau 10 : Nombre de lésions de EthénoGuanine , EthénoAdénine , diols de thymines par plasmide pAlkB 5 . Les plasmides portant des pontages Les agents chimiques créant des pontages intra et inter-brins sont pour certains très largement utilisés dans de traitement de cancers . Etre capable de mesurer les capacités de réparation cellulaire de ces dommages peut donc se révéler intéressant , par exemple pour l' étude de la résistance aux chimiothérapies . Nous avons donc choisi de mettre sur la biopuce un plasmide comportant des adduits réalisés avec le CDDP ( pCisP ) , mais aussi un plasmide comportant des adduits réalisés avec le 8- methoxypsoralène ( pPso ) . a ) Plasmide portant des pontages et des adduits CDDP Le CDDP est une molécule qui a la capacité de former plusieurs types de dommages . Tout d' abord , elle peut faire des adduits monofonctionnels sur la guanine qui évoluent cependant rapidement en adduits bifonctionnels . Les adduits bifonctionnels peuvent conduire à des pontages intra-brin entre une guanine et une adénine adjacente ( intra- 1 , 2-d ( ApG ) ) , mais aussi entre deux guanines adjacentes ( intra- 1 , 2-d ( GpG ) ) ou séparée par un nucléotide ( intra- 1 , 3-d ( GpNpG ) ) . Le pontage inter-brins quant à lui a lieu entre deux guanines appartenant chacune à un brin différent ( inter-d ( GpC ) d ( GpC ) ) . Les proportions des différents types de pontages sont présentés dans le Tableau 11 . Notons que les pontages inter-brins sont très minoritaires ( < 2 % ) . Tableau 11 : Pourcentage des différents types de pontages réalisés par le CDDP Le plasmide portant ces dommages a été nommé pCisP. Nous n' avons pas pu doser le nombre d' adduits du CDDP que nous avions sur le plasmide pCisP . b ) Plasmide portant des pontages et des adduits de 8- methoxypsoralène ( 8-MOP ) Le 8- methoxypsoralène est un composé qui nécessite d' être photoactivé pour réaliser des adduits sur l' ADN . Cette caractéristique le rend particulièrement adapté au traitement de maladies cutanée telle que le psoriasis . Il est cependant aussi utilisé dans le traitement de certains cas de lymphomes , il est alors photoactivé lors du passage du sang du patient dans un système circulatoire externe . Cette photoactivation a lieu aux longueurs d' onde des UVA ( 320 - 400 nm ) . Elle conduit , si le 8-MOP est intercalé dans l' ADN , à la formation de pontages inter-brins . Ces pontages ont lieu entre deux thymines appartenant à deux brins différents . Des monos adduits peuvent aussi être formés sur une seule thymine ( Figure 25 ) . Figure 25 : En a molécule de 8-MOP , en b pontage inter-brins de deux thymines par le 8-MOP La réparation des mono adduits est entièrement prise en charge par la REN , alors que les pontages , tout comme ceux produits par le cisplatine , sont dans une première étape excisés par la REN , puis la RH ou la RNH finissent le processus de réparation . Sur la biopuce le plasmide comportant ce type de lésion est nommé pPso . Nous n' avons pas pu doser le nombre de pontages que nous avions par plasmide , car la méthode de mesure par CLHP-SM / SM de ces lésions n' est pas au point . 6 . Plasmide portant des sites abasiques Le plasmide qui porte les sites abasiques est nommé pAbaS. Ils font partie des lésions qui se forment spontanément dans l' ADN , et leurs conséquences peuvent être graves car ils sont potentiellement mutagènes et bloquent la transcription ainsi que la réplication . Dans la cellule , ils sont pris en charge par la réparation par excision de bases . Les conditions que nous avons utilisées pour former les sites abasiques sont basées sur une forte température et un pH acide . Dans ces conditions , leur formation spontanée est fortement accélérée ( Figure 26 ) . Figure 26 : Principe de formation des sites abasiques Pour réaliser les dosages des sites abasiques , nous les avons tout d' abord digérés avec l' Endo VII ou la T4 endonucléase , puis nous avons réalisé une électrophorèse sur gel d' agarose des plasmides . Si un plasmide possède un site abasique et que ce dernier est digéré alors le plasmide passe de la forme circulaire super enroulée à la forme circulaire qui migre moins rapidement lors de l' électrophorèse . A l' aide de cette méthode , nous avons pu montrer que 50 % des plasmides traités présentaient un site abasique , et que , par conséquent , la population de plasmides pAbaS comporte 0 , 5 sites abasiques . D . Organisation des dépôts sur la biopuce Au cours de cette étude , deux formats ont principalement été utilisés . Un format que nous appellerons 9x9 ( 4 mm x 4 mm ) formant un carré de neuf dépôts par neuf dépôts , et un autre format de vingt dépôts par quatre nommé 20x4 ( 8 , 5 mm x 1 , 5 mm ) . L' agencement des dépôts de chaque format a été dicté par le format des chambres d' incubation que nous avons utilisées pour réaliser les réactions . Dans le cas du format 9x9 les chambres de réaction , de par leur taille , ne permettaient de faire que trois biopuces par lames , et leur volume était de 25 µl . Le format 20x4 a alors été adopté lorsque nous avons fait faire des caches comportant six chambres de réaction , permettant donc réaliser six biopuces par lame support avec un volume réactionnel de 20 µl . Les deux types de dépôt sont composés des plasmides précédemment décrits , à savoir pControl , pCPD- 64 ( pCPD- 64 * pour le format 9x9 ) , p 8 oxo ( p 8 oxo * pour le format 9x9 ) , pAlkB , pCisP , pPso , pAbaS , pThymG ( parfois non présent sur les biopuces au format 9x9 ) . Dans les deux formats , les plasmides comportant les dommages sont déposés en tripliqua et en trois dilutions 1 / 2 , 3 / 4 et 1 respectivement appelées A , B , et C. Les dilutions des plasmides sont réalisées dans du plasmide contrôle afin de garder constante la quantité d' ADN du dépôt . Ces dilutions permettent de vérifier que les activités enzymatiques sont dépendantes de la quantité de dommages , ce qui renseigne sur la spécificité de la réaction . Dix huit dépôts de pControl sont présents sur le format 9x9 , alors que dix sept sont déposés pour le format 20x4 . Le plan de dépôt des deux formats est présenté ci-dessous Figure 27 . Figure 27 : Présentation des deux formats de dépôts : en a le format 9x9 ayant les plasmides pCPD- 64 * et p 8 oxo * . En b est présenté le format 20x4 . II . Réalisation des dépôts à l' aide du robot de dispense A . Le robot de dispense ScieFlexarrayer 1 . Présentation du robot et caractéristiques techniques Pour réaliser les dépôts sur support , nous avons utilisé le robot de dispense ScieFlexarrayer de la société Scienion . Ses caractéristiques techniques sont : La possibilité de déposer des échantillons sur 24 lames support L' utilisation de la technologie piézoélectrique pour réaliser la dispense . L' utilisation de servos magnétiques linéaires pour les déplacements du bras mobile ( vitesse de déplacement : 16 cm . s- 1 ; précision : 5 µm ) . Les déplacements de liquide sont tous réalisés à l' aide de pompes péristaltiques , que ce soit pour le lavage de la buse ou pour l' aspiration / évacuation de l' échantillon . Une enceinte de protection évite que les particules présentes dans l' air ne se déposent sur la zone de travail , et permet de maintenir , à l' aide d' un humidificateur , une hygrométrie constante . 2 . Fonctionnement du robot Le robot de dispense est composé de plusieurs organes décrits sur la figure 28 . La réalisation des dépôts se déroule comme suit : C' est au niveau de la buse de dispense en verre ( 1 ) que les gouttes de solution à déposer sont émises . Un bras mobile permet de déplacer la buse de dispense ( 2 ) , et ainsi d' aller prélever l' échantillon au niveau de la plaque 96 puits ( 3 ) grâce à la pompe péristaltique d' aspiration / évacuation ( 4 ) . Une caméra ( 5 ) permet alors de s' assurer que la buse dispense de manière correcte les gouttes . Le dépôt des plasmides sur les lames supports peut alors avoir lieu ( 6 ) . Une fois que les dépôts d' un échantillon ont été réalisés , la buse de dispense est alors nettoyée au niveau de la station de lavage ( 7 ) , l' extérieur de la buse est lavé par de l' eau envoyée par la pompe péristaltique de lavage ( 8 ) , l' intérieur de la buse est aussi nettoyé par de l' eau mais envoyée par la pompe d' aspiration / évacuation . Le processus reprend alors pour l' échantillon suivant . Figure 28 : Photo du robot ScieFlexarrayer que nous utilisons pour réaliser les dépôts , il est présenté sans son enceinte de protection 3 . La technologie de dispense piézoélectrique La technologie piézoélectrique est une technologie de pointe pour la réalisation de dispense de volume de l' ordre du pico litre . Elle a été développée à la base pour les imprimantes à jet d' encre et bénéficie donc de longues années de développement et d' améliorations techniques . Lorsque les biologistes ont voulu réaliser des dispenses de faible volume , c' est tout naturellement qu' une partie d' entre eux s' est tournée vers cette méthode , l' autre partie s' étant tournée vers la réalisation des dépôts par contact . Cette technologie tire profit des caractéristiques physiques des cristaux piézoélectriques qui ont la capacité de se contracter s' ils sont parcourus par un courant électrique . C' est cette contraction qui est utilisée au niveau de la buse de dispense en verre pour expulser sous forme de gouttes le liquide que l' on veut déposer . On peut observer sur la Figure 29 la formation etl'éjection au niveau de la buse d' une goutte de liquide . Figure 29 : Images obtenues à l' aide de la caméra du robot montrant la formation et l' expulsion des gouttes au niveau de la buse de dispense . Le diamètre de la buse de dispense est de 50 µm . Le fait que l' éjection de la goutte soit produite par un courant électrique donne à l' utilisateur la possibilité de contrôler plusieurs paramètres . Ainsi , avec le logiciel de pilotage du robot , on peut facilement choisir le nombre de gouttes que l' on veut réaliser par dépôt . Mais nous avons aussi accès aux paramètres de réglage agissant sur les caractéristiques physiques de la goutte . En jouant sur le voltage et la durée du courant qui est envoyé au cristal piézoélectrique , il nous est possible de régler le volume et la vitesse de sortie de la goutte . Le volume typique des gouttes que nous utilisons est de 500 pl. Le système de dispense piézoélectrique présente de nombreux avantages . Tout d' abord , comme nous venons de le voir , il offre un contrôle total sur les caractéristiques physiques des gouttes et donc du volume du dépôt . De plus , la dispense piézoélectrique est très rigoureuse , à savoir que le volume des gouttes expulsées est assez stable au cours des différentes dispenses . Enfin , le dernier avantage est qu' il n' y pas de contact lors de la réalisation du dépôt . Cet avantage est particulièrement important dans notre cas car nous avons choisi de déposer les plasmides sur un gel potentiellement fragile . Cette technologie souffre cependant d' un inconvénient majeur lié aux problèmes inévitables de micro-fluidiques qui apparaissent dès que des faibles volumes de solution doivent être déplacés dans des capillaires de diamètre réduit . Aussi , la formation de bulles d' air ou l' accumulation de particules contaminantes peuvent perturber fortement la dispense du liquide . Lors de l' utilisation du robot , une attention toute particulière doit donc être apportée à ces sources potentielles de problèmes . B . Mise au point des paramètres de dépôt Avant de fabriquer les biopuces , nous avons dû régler le robot et nous assurer que nous étions dans des conditions optimales . Plusieurs éléments ont été vérifiés et sont présentés dans cette partie . 1 . Le lavage de la buse de dispense Le lavage de la buse de dispense est très important car c' est une étape qui doit permettre d' éliminer toute trace de l' échantillon qui vient d' être déposé , et ainsi éviter la contamination des dépôts de l' échantillon suivant . Le lavage doit donc permettre l' élimination du volume d' échantillon aspiré ainsi que les molécules qui peuvent rester piégées dans les microporosités de la buse de dispense . Le robot offre la possibilité de laver l' extérieur de la buse de dispense , mais aussi l' intérieur . Pour le lavage de l' intérieur de la buse , l' aspiration de l' échantillon se fait grâce au système liquide qui est sous le contrôle de la pompe péristaltique d' aspiration / évacuation . Ce système liquide est composé d' eau , il existe donc par conséquent une interface entre l' eau et l' échantillon d' intérêt . Lorsque la pompe du système liquide vide l' échantillon , il est le premier à être éliminé , puis c' est l' eau du système liquide qui sort ( Figure 30 ) . Le premier paramètre que nous pouvons régler est la durée et la puissance avec laquelle l' échantillon est vidé , ceci permet de contrôler le lavage interne de la buse : plus ce temps est long et plus de l' eau du système liquide aura nettoyé les parois de la buse . Le second paramètre est la puissance de la pompe de lavage et la durée pendant laquelle la buse est lavée , on peut ainsi régler le débit de l' eau de lavage qui va nettoyer l' extérieur de la buse . Figure 30 : Fonctionement du système d' aspiration et de vidage de l' échantillon Nous avons choisi de mettre au point un lavage long et basé sur deux étapes , afin de diminuer au maximum les contaminations . Voici brièvement son déroulement : Tout d' abord , la buse de dispense vide son contenu au dessus de la station de lavage . La buse est ensuite plongée dans la station de lavage où de l' eau nettoie l' extérieur du capillaire . Pendant ce temps la buse continue de vider son contenu tout en étant soniquée . Pour tester l' efficacité de ce lavage , nous avons réalisé des dépôts alternés de solutions de nucléotide fluorescent ( dUTP-Cy 5 ) et d' eau : le robot déposant d' abord une solution de nucléotide fluorescent puis l' eau . Les résultats de l' expérience sont présentés sur la Figure 31 . On observe qu' il n' y a pas de signal fluorescent au niveau des dépôts de solution d' eau . Ceci nous indique donc que le programme de lavage de la buse de dispense que nous avons mis au point est suffisamment efficace pour qu' il n' y ait pas de contamination lors des prélèvements successifs de solutions . Figure 31 : Test du programme de lavage utilisé lors de la réalisation de dépôts . Trois solutions de dUTP-Cy 5 1 mM au 1 / 20000 ont été déposées en alternance avec des solutions d' eau sur une lame d' hydrogel . La lecture à été éffectuée avec un gain PMT de 430 et une puissance de laser de 100 % 2 . Choix du nombre de gouttes par dépôt La technologie piézoélectrique offre la possibilité de choisir le nombre de gouttes que l' on veut par dépôt . Dans un souci d' optimisation , nous avons voulu savoir si le nombre de gouttes pouvait avoir une influence sur la qualité des dépôts . Nous avons donc mis au point une expérience qui nous a permis de mesurer l' écart-type des dépôts intra et inter-biopuces . Pour cela , nous avons réalisé trois séries de biopuces en duplicate . Sur la première série , les dépôts sont réalisés à partir d' une seule goutte , de deux gouttes sur la deuxième et de trois gouttes sur la troisième . L' échantillon que nous avons utilisé est une solution de dUTP-Cy 5 à 1 mM , qui a été déposée sur chaque biopuce en quatre dilutions : 1 / 64000 , 1 / 16000 , 1 / 8000 , 1 / 4000 , pour chaque dilution six dépôts sont présents par biopuce et permettent ainsi de calculer des écarts-types . Nous avons tout d' abord étudié l' effet du nombre de gouttes sur la variabilité de la fluorescence des dépôts intra-biopuce . Pour cela , le pourcentage d' écart-type des dépôts d' une même dilution a été calculé pour chaque série de biopuce , et reporté sur la Figure 32 . Le pourcentage d' écart type correspond au pourcentage de la valeur de l' écart-type par rapport à la valeur de l' intensité de fluorescence . Figure 32 : Test de l' effet du nombre de gouttes sur le pourcentage d' écart-type de fluorescence des dépôts d' une même biopuce . L' histogramme présente le pourcentage d' écart-type de fluorescence des dépôts de différentes dilutions de solution de dUTP-Cy 5 obtenus avec 1 , 2 ou 3 gouttes par dépôt . On constate que pour les dépôts réalisés avec une seule goutte , le pourcentage d' écart type est dépendant de la dilution et qu' il est supérieur à celui des dépôts réalisés avec deux gouttes ou trois gouttes . Ce lien entre les pourcentages d' écart-type des dépôts et la dilution de la solution de Cy 5 disparaît à mesure que le nombre de gouttes augmente . Avec trois gouttes par dépôt , on observe un pourcentage d' écart-type inférieur à 10 % et indépendant de la dilution . Nous avons ensuite comparé les signaux de fluorescence obtenus entre les deux biopuces dupliqua d' une même série , afin d' observer si le nombre de gouttes par dépôt avait aussi un effet sur la reproductibilité inter biopuces . Sur la Figure 33 est présenté le niveau de fluorescence des dilutions des dupliquas de chaque série de biopuces . Figure 33 : Test de l' effet du nombre de gouttes sur le niveau de fluorescence des dépôts . Les histogrammes présentent la fluorescence médiane des dépôts de différentes dilutions de solution de dUTP-Cy 5 de biopuces duplicate obtenues avec 1 , 2 ou 3 gouttes par dépôt . Les histogrammes n' ont pas la même échelle en intensité de fluorescence car les lames ont été lues à des puissances différentes . On observe que le nombre de gouttes par dépôt a aussi un effet sur la reproductibilité des signaux inter biopuces . Lorsque les dépôts sont réalisés avec une goutte , le niveau de fluorescence des biopuces en dupliqua n' est pas identique : on observe un écart d' environ 18 % , lorsque |